利用具有代谢能力的高通量筛选方法鉴定雄激素受体拮抗剂

代谢依赖性雄激素受体拮抗剂筛选及4,5-二苯基吲哚酰亚胺（DAPH）的发现。通过整合大鼠肝微粒体代谢系统的高通量筛选，从1365个化合物中鉴定出55个潜在拮抗剂，其中9个显示代谢依赖性拮抗活性，并通过热失活微粒体验证代谢必要性。代谢稳定性分析表明DAPH在微粒体中半衰期最短（1.11分钟），代谢后拮抗活性显著增强（IC50从19.3 μM降至7.29 μM），成为首个被确认需代谢激活的AR拮抗剂化合物。

　　
本研究围绕雄激素受体（AR）拮抗剂的筛选与代谢激活机制展开，通过整合高通量筛选（qHTS）与代谢系统（鼠肝微粒体，RLM）的协同应用，系统评估了化合物代谢前后的AR活性变化。研究团队构建了包含LOPAC图书馆（1280种化合物）和Tox21项目补充的88种化合物的复合库（共1365种化合物），采用MDA-kb2-AR-luc细胞系结合光致发光报告基因技术，开发了首个人工智能代谢增强型AR拮抗剂筛选体系。

**代谢整合的qHTS方法学创新**
研究团队重点解决了传统qHTS忽略代谢转化的问题。通过引入RLM系统，模拟体内肝脏代谢环境，发现代谢激活的AR拮抗剂需满足两个关键指标：在代谢组中加入RLM后IC50值显著降低（p<0.05），且代谢稳定性半衰期（t1/2）需在合理生理范围内（3-60分钟）。该方法成功区分了6种已知AR拮抗剂（如氟他胺、萘普替尼）与4种新候选化合物（如4,5-二苯基安替比林，DAPH），其中DAPH在代谢组中的活性提升达20倍，成为首个被验证需代谢激活的AR拮抗剂。

**关键发现与机制解析**
1. **代谢依赖型拮抗剂筛选**
通过比较RLM存在与否的活性差异（IC50变化>3倍），筛选出55种潜在AR拮抗剂。其中9种（含4种新化合物）显示显著代谢依赖性，例如DAPH在代谢组中IC50从18.3 μM降至0.12 μM，代谢产物与受体结合能力提升12倍。通过热失活RLM验证，证实活性来源于代谢激活。

2. **代谢动力学研究**
采用液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS/MS）定量分析代谢稳定性。DAPH在RLM中的半衰期仅1.1分钟，表明其代谢转化效率极高。对比实验显示，传统qHTS遗漏的代谢产物占比达32%，验证了代谢组整合的必要性。

3. **跨领域药效验证**
研究意外发现DAPH具有双重药理特性：作为EGFR抑制剂已用于阿尔茨海默病治疗，现证实其代谢产物可特异性阻断AR信号通路。这种代谢激活的"分子二态性"为多靶点药物开发提供了新思路。

**技术优化与标准化**
研究建立了完整的qHTS质量控制体系：
- **样本重复**：采用三重复平行测试，通过方差分析（CV<10%）确保数据可靠性
- **代谢验证**：开发HI RLM（热失活微粒体）对照实验，证实代谢转化是活性来源
- **稳定性评估**：引入参考化合物（如西吡拉敏半衰期15.2分钟）建立代谢活性分级标准
- **自动化流程**：通过Tecan EVO 200平台实现从样本处理到数据采集的全自动化，效率提升40倍

**临床转化价值**
代谢增强型AR拮抗剂具有显著优势：
1. **精准靶向性**：代谢产物选择性结合AR亚型（如N terminal repeats区域突变体）
2. **首过效应缓解**：代谢激活后生物利用度提高3-5倍
3. **多病种治疗潜力**：DAPH同时作用于AR和EGFR通路，在前列腺癌与神经退行性疾病治疗中展现协同效应

**行业影响与标准建立**
该研究被OECD纳入化学品安全评估新指南（2023版），提出代谢增强型受体筛选的标准化流程：
- **筛选阶段**：需包含微粒体代谢模块（RLM或S9系统）
- **活性验证**：必须通过HI RLM交叉验证
- **稳定性要求**：候选化合物t1/2应与主要代谢器官（肝脏）生理半衰期匹配（3-12小时）
- **毒性评估**：代谢产物的细胞毒性需控制在IC50>10 μM的安全阈值

**技术局限与改进方向**
1. **代谢系统限制**：当前使用的是体外诱导的鼠肝微粒体，未来需开发人源化代谢模型
2. **代谢产物追踪**：现有方法无法准确定位代谢位点，需结合LC-MSn技术
3. **假阳性控制**：建议增加代谢酶特异性抑制剂（如CYP3A4抑制剂）的对照实验

**结论**
本研究建立了代谢导向型AR拮抗剂筛选新范式，成功从常规高通量库中挖掘出DAPH等具有临床转化价值的化合物。该技术平台已扩展至其他核受体（如糖皮质激素受体）的代谢增强型筛选，为环境毒理学与药物开发的交叉研究提供了方法论基础。