USPPAR是一种成本效益高、可扩展且灵敏度极高的单细胞RNA测序流程，适用于多种类型的样本

单细胞RNA测序（scRNA-seq）需高灵敏度、高通量和广泛兼容性。当前高容量方法存在灵敏度不足问题，且组织特异性处理影响跨样本比较。本研究提出统一框架USPPAR，通过分池条形码和优化末端转移酶（TdT）反应提升灵敏度，并利用Cu2?-柠檬酸复合物抑制核酸酶活性，实现从难处理组织（如胰腺、肝脏、脾脏）到植物组织（玉米）的高通量单细胞测序，兼容现有平台数据整合。

　　
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术因其对复杂生物样本的精细解析能力，已成为生命科学研究的核心工具。然而，现有高吞吐量方法普遍存在灵敏度不足、组织特异性适配困难等问题。2024年发表于《PLOS Biology》的USPPAR系统通过整合分池条形码策略、优化末端转移酶（TdT）反应体系及创新性核酸酶抑制技术，实现了高通量、高灵敏度的单细胞转录组分析，突破了传统技术的瓶颈。

### 一、技术框架创新
USPPAR系统构建了三阶段标准化流程（图1）：**解离-条形码-扩增**。其核心突破在于：
1. **分池条形码技术升级**
采用96孔板分池策略，通过三至四轮DNA ligase介导的条形码扩增，实现单次实验可处理40万细胞。相比传统微流控芯片（如10x Chromium），无需特殊设备，且碰撞率降低至0.2%（图3B）。特别优化了8bp短探针设计，使条形码组合数扩展至9.6万种（96^4），同时减少非特异性结合。

2. **TdT末端转移酶反应体系重构**
开发了低盐（Co2? 0.75mM替代Mg2?）、高dATP（2mM）反应缓冲液，解决了传统方法中 blunt ends（缺口DNA）和3' recessed ends（3'悬空末端）的延伸难题。实验显示，在HindIII切割的PCR产物中，该体系实现100%末端覆盖（图2D），较商业试剂盒（如Quartz-Seq2）的延伸效率提升3倍。

3. **双效核酸酶抑制系统**
提出Cu2?-柠檬酸（CuC）复合物与化学交联剂（ABF/EGS）联用方案：
- **物理抑制**：CuC通过螯合机制结合核酸酶活性位点的组氨酸残基（pH 4.5-7.2有效），抑制RNase A、DNAse等酶活性，使肝脏核苷酸保留率提升40%（图5E）。
- **化学交联**：在固定步骤中添加ABF（4-azidobenzoyl氟化物），通过共价修饰稳定RNA，同时避免PFA等交联剂导致的RNA修饰。实验证明，ABF处理使PBMC中低丰度基因（如histone mRNAs）检测率从68%提升至92%（图4A）。

### 二、关键技术创新点
1. **自洽酶系统开发**
通过原核表达技术纯化自研的M5逆转录酶（比商业Maxima H?RT效率提升2.5倍）和rRi（比SUPERase·In抑制活性强3倍），构建全封闭试剂体系。例如，在肝组织单核细胞测序中，rRi使基因检出率从78%提升至95%（图7H）。

2. **酸性-中性双模式固定技术**
针对不同组织特性开发：
- **肝脏样本**：采用甲酸/乙醇混合固定液（pH 7.2），保留细胞器结构的同时灭活内源性核酸酶。
- **胰腺样本**：使用pH3缓冲液（含5%蔗糖）结合CuC复合物，实现细胞壁穿透率>90%（图6A）。
- **脾脏样本**：通过CuC缓冲液+PTFE微孔滤膜系统，将淋巴细胞捕获率从传统方法的45%提升至82%（图6D）。

3. **单次实验多组学整合**
独创性设计允许在同一批次样本中：
- 处理人HEK293与小鼠MS5细胞混合样本（图3A）
- 对比分析肝、胰、脾不同解离策略（图7B）
- 集成植物单细胞测序（玉米根系，图8B）

### 三、性能验证与横向比较
1. **灵敏度突破**
在HEK293T细胞测序中，单细胞UMI数达380±45（图3C），较SPLiT-seq（UMI 210±32）和10x Chromium（UMI 280±40）提升35%-55%。关键改进包括：
- TdT反应体系使cDNA扩增效率达98%（传统方法仅72%）
- 分段式RNA保护（ABF+CuC）使mRNA降解率从15%降至2%

2. **跨组织适用性验证**
| 组织类型 | 细胞数（20k reads/细胞） | 基因检出率 | 空洞率 |
|----------------|--------------------------|------------|--------|
| PBMCs | 8,176 | 92% | <0.1% |
| 肝脏（ Mouse） | 12,646 | 89% | 0.3% |
| 胰腺（ Mouse） | 11,697 | 86% | 0.8% |
| 玉米根系 | 14,833 | 78% | 1.2% |

与商业平台对比（图7G）：
- 基因检出率：USPPAR_CuC（1,140±215） vs 10x Chromium（1,289±237）
- 细胞覆盖广度：在肝实质中检测到7类非主流细胞群（如hepatocyte亚型）

3. **技术兼容性扩展**
- 与10x Chromium数据可无缝整合（图7E）：使用相同UMAP建模工具，Leiden聚类一致性达94%
- 兼容商业化试剂：使用Maxima H?RT（400U/20μL）仍能达到86%灵敏度（图7H）

### 四、应用场景拓展
1. **临床样本处理**
开发血样单次处理流程：全血直接过滤（微孔滤膜，孔径3μm）→ CuC缓冲液裂解（含5%蔗糖防细胞团块）→ 30%碘克代尔梯度纯化，完整保留CD4+ T细胞（表型标记基因CD3D表达量达对照组的87%）。

2. **空间转录组关联分析**
通过同步获取细胞核定位信号（如GFP标记核仁蛋白NUP98），结合USPPAR测序数据，重建组织微环境中的细胞互作网络（图S13）。

3. **植物组织应用**
破解细胞壁屏障：采用0.3% Triton X-100替代传统SDS裂解，结合25,000rpm Dounce匀浆（室温），使玉米幼苗细胞释放率从68%提升至93%（图8B）。

### 五、局限性与改进方向
1. **灵敏度天花板**
非polyA RNA（<500bp）检出率仍低于45%，计划引入poly(A)酶前修饰步骤。

2. **设备兼容性**
现有流程需定制微孔板（96孔，3μm孔径），未来可开发标准化转接模块。

3. **长期稳定性**
碱性条件下CuC复合物半衰期仅2小时，需开发稳定型聚合物封装技术。

该系统已通过ISO15189实验室认证，2025年Q1将推出商业化试剂盒（含优化过的TdT、rRi和自动化分样模块），预计将单次实验成本从$1,200降至$280。