通过对甲虫具有防御性气味的臭腺功能相关基因的全基因组鉴定，发现Laccase2是一种负责合成有毒对苯醌的酚氧化酶

《PLOS Genetics》：Genome-wide identification of genes involved in beetle odoriferous defensive stink gland function recognizes Laccase2 as the phenoloxidase responsible for toxic para-benzoquinone synthesis

防御性臭腺功能相关的490个基因通过RNA干扰筛选和转录组学分析鉴定，揭示Laccase2在合成有毒para-苯醌中的作用，发现40%基因无果蝇同源物，凸显基因组注释对解析新功能的重要性。

　　
红 flour beetle（Tribolium castaneum）的防御腺体功能基因组学研究揭示了昆虫化学防御机制的复杂性和进化多样性。该研究通过整合RNA干扰筛选与转录组学分析，系统性地鉴定了与防御腺体功能相关的490个基因，并首次明确了苯酚氧化酶Laccase2在合成有毒对苯二醌过程中的关键作用。

### 研究背景与意义
防御腺体是甲虫等昆虫的重要适应性结构，其分泌物通过驱赶捕食者、抑制微生物生长或直接毒性实现自我保护。这类腺体在甲虫中多次独立进化，但传统研究多聚焦形态学或化学生态学分析，缺乏分子层面的系统性解析。红 flour beetle作为模式生物，具备完善的遗传工具和大规模RNA干扰筛选平台（iBeetle），使其成为研究防御腺体分子机制的理想对象。

### 研究方法
1. **iBeetle RNA干扰筛选**
通过三次迭代筛选（覆盖78%基因组），采用靶向基因的dsRNA注射，结合形态学观察和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），鉴定了178个新基因。第三阶段筛选效率提升至4%（178/4520），主要得益于直接解剖腺体观察形态变化，而非依赖成虫表皮表型（如活动性、趋光性等）。

2. **转录组学深度解析**
基于2020年新发布的Tcas5.2基因组注释（OGS3），重新分析2013年发表的腺体转录组数据。通过设定更严格的丰度阈值（log2FC≥4），结合四类腺体（雌/雄胸腺、腹腺）与前胸部的对比分析，筛选出249个腺体特异性基因。其中41个为新注释基因，通过RNA干扰验证了其功能。

3. **基因功能与进化分析**
利用ShinyGO、BlastKOALA和eggNOG-mapper进行功能注释，发现490个基因主要涉及：
- **膜运输与分泌**（如溶酶体、囊泡运输相关基因）
- **代谢途径**（酚类、醌类合成相关酶）
- **信号通路**（MAPK、胰腺分泌通路）
值得注意的是，40%的基因（约200个）在果蝇（D. melanogaster）中无明确功能同源物，表明甲虫防御腺体可能演化出独特的生物合成通路。

### 主要发现
1. **基因组规模的功能模块**
筛选出的490个基因形成三大功能集群：
- **分泌途径**：占35%（170基因），包括膜蛋白转运体、糖苷酶（催化酚类前体加工）等。
- **毒性代谢**：占28%（135基因），如苯酚氧化酶（Laccase2）、细胞色素P450酶系。
- **细胞保护机制**：占22%（107基因），包括溶酶体膜蛋白、抗氧化酶（如硫氧还蛋白过氧化物酶）。

2. **Laccase2的发现与功能验证**
通过iBeetle筛选和转录组学双重验证，确认Laccase2（Tc_lac2）在防御腺体中的核心作用：
- **催化对苯二醌合成**：以邻苯二酚为底物，生成具有强烈毒性的对苯二醌（MBQ/EBQ）。RNA干扰实验显示，敲除Laccase2会导致腺体分泌物完全丧失MBQ/EBQ（图5C-D）。
- **组织特异性表达**：通过荧光原位杂交（FISH）定位发现，Laccase2主要在腺体分泌细胞2b亚型中表达，该细胞紧邻含毒性合成的囊泡结构，确保酶与底物的精准接触。
- **双重功能机制**：该酶在成虫阶段负责防御腺体中对苯二醌的合成，而在幼虫阶段参与表皮黑化（cuticle sclerotization）所需的邻苯二醌生成，体现功能分化。

3. **进化与功能创新**
- **果蝇同源基因缺失**：40%的基因无果蝇同源物，提示甲虫防御腺体可能通过非保守基因（如新注释的ARSB亚硫酸酯酶）实现独特功能。
- **分子机制创新**：与无脊椎动物（如 rove beetles）相比，红 flour beetle的防御腺体采用“单酶多途径”策略——Laccase2同时参与表皮黑化和防御物合成，而其他昆虫可能通过基因冗余或分化酶实现相同功能。
- **合成前体调控**：检测到13个基因（如糖苷酶Tc_015339）可能参与防御物前体的跨膜运输，但缺乏已知的果蝇同源基因，暗示甲虫可能发展出全新的转运机制。

### 关键突破
1. **iBeetle筛选技术优化**
第三阶段通过直接解剖腺体，发现传统表型筛选（依赖整体行为变化）可能遗漏25%的功能基因（如Tc_008780编码的ABC转运蛋白），该基因仅通过腺体形态缩小（如囊泡体积减少）和挥发物组成变化（MBQ/EBQ减少）被识别。

2. **基因组注释驱动的功能发现**
OGS3注释新增的1452个基因中，37%与腺体功能相关。例如，Tc_033013（无GO注释）被证明编码分泌囊泡膜蛋白，其敲除导致腺体分泌物外渗并引发微生物感染。

3. **防御合成通路的空间化**
腺体结构解析显示，分泌过程具有严格区域化：
- **细胞类型1**：负责储存和释放（分泌细胞呈单个或成对分布，包裹大囊泡）。
- **细胞类型2**：分化为2a（合成前体）和2b（终末氧化酶表达）亚型，其中2b细胞紧邻囊泡，是Laccase2的定位场所。

### 讨论与启示
1. **功能基因的进化策略**
- **趋同进化**：不同昆虫可能通过相似通路（如苯酚氧化酶）实现防御物合成，但分子基础差异显著。例如，果蝇缺乏防御腺体，但其laccase家族基因在幼虫阶段参与表皮色素合成。
- **基因冗余与功能分化**：甲虫中Laccase2的两种剪接变体（Tc_010489/490）分别参与表皮黑化和腺体防御物合成，体现功能分化的早期阶段。

2. **合成生物学与害虫防控**
- **关键酶靶向**：Laccase2的抑制可阻断对苯二醌合成，为开发新型昆虫生长调节剂（IGRs）提供靶点。
- **代谢工程潜力**：通过异源表达Tc_010489（高表达亚型）可增强防御物产量，但需解决在非甲虫宿主中的毒性泄漏问题。

3. **系统生物学挑战**
- **功能注释瓶颈**：213个无果蝇同源基因的功能解析需依赖新模型（如基因编辑技术CRISPR-Cas9结合腺体特异性启动子）。
- **通路互作网络**：当前研究揭示了基因的模块化功能（分泌、氧化、储存），但跨模块调控（如MAPK信号对酶活性的调控）仍待深入。

### 结论
该研究首次构建了红 flour beetle防御腺体的全基因组功能图谱，鉴定了490个关键基因，其中Laccase2的功能解析填补了甲虫与果蝇在苯醌代谢中的分子差异。研究证实防御腺体可能通过“功能叠加”实现高效合成（如单酶催化多步反应），为理解昆虫化学生态和开发靶向害虫的新农药提供了理论依据。未来研究可聚焦于以下方向：
1. **合成通路动态模拟**：结合代谢组学与基因表达时空图谱，解析前体物质（如DOPA）的运输与氧化节点的协同机制。
2. **进化比较分析**：对比罗ove beetles（已发现平行进化路径）的防御腺体基因，揭示甲虫防御系统的独特进化路径。
3. **基因功能冗余评估**：通过基因敲除芯片验证213个无同源基因的功能，重点筛选对苯二醌合成直接参与的基因（如硫解酶、脂质转运蛋白）。

该成果不仅为昆虫化学防御研究提供了新的技术范式（基因组筛选+结构生物学验证），更为合成生物学改造甲虫行为（如拒食信息素合成）奠定了基础。