未修饰和核苷修饰的mRNA构建体编码的弓形虫（Toxoplasma gondii）GRA1蛋白的体外表达及其血清反应性

《Gene》：In vitro expression and seroreactivity of Toxoplasma gondii GRA1 protein encoded by unmodified and nucleoside-modified mRNA constructs

mRNA疫苗平台在 toxoplasmosis 防治中的应用研究，通过设计未修饰和核苷修饰mRNA表达GRA1蛋白，发现未修饰mRNA的蛋白表达量显著更高，且抗原与感染小鼠血清存在特异性反应，提示其作为疫苗候选的潜力。

本研究团队来自土耳其伊兹密尔大学疫苗开发与应用研究中心，聚焦于 toxoplasmosis（弓形虫病）的疫苗研发。弓形虫由 Toxoplasma gondii 寄生体引起，全球约三分之一人口受感染，对孕妇、免疫缺陷人群及畜牧业均构成威胁。尽管已有针对羊群的减毒活疫苗 Toxovax?，但人类仍缺乏有效疫苗，促使研究团队探索 mRNA 技术平台。

研究核心在于首次利用 mRNA 表达弓形虫密度颗粒抗原1（GRA1）蛋白。该蛋白具有双重 Ca2? 结合结构域，在宿主免疫应答调控和包囊形成中起关键作用，其免疫原性已在多动物模型中得到验证。团队构建了两种 mRNA 构建体：一种是未修饰的天然mRNA，另一种采用核苷修饰技术（m1Ψ替代尿嘧啶）以增强稳定性。为优化翻译效率，设计包含人类α-球蛋白 5' UTR、FI元件 3' UTR，并控制 poly-A 尾巴长度（常规120bp，实验组延长至270bp）。

体外实验显示，未修饰mRNA在 HEK293T 细胞中表达的重组 GRA1 蛋白量显著高于核苷修饰组（p<0.05）。这可能与修饰核苷影响mRNA稳定性或翻译起始效率有关。延长 poly-A 尾巴虽能增强mRNA稳定性，却导致表达量下降，提示需平衡mRNA半衰期与翻译效率的优化策略。值得注意的是，所有mRNA组均能诱导目标蛋白表达，且该蛋白与感染小鼠血清中的 IgG 抗体发生特异性结合，通过 IFAT 和 ELISA 验证了其免疫原性。

研究创新性体现在三个层面：首先，将 GRA1蛋白作为新型疫苗抗原，弥补了现有研究多集中于 SAG1、ROP2A 等蛋白的空白；其次，构建了双模态 mRNA 系统（未修饰与核苷修饰），为疫苗递送策略提供对比数据；第三，引入 poly-A 尾巴长度调控变量，为优化mRNA稳定性与翻译效率提供实验依据。结果证实未修饰mRNA在蛋白表达量上具有优势，但核苷修饰可能提升疫苗在冷链运输中的稳定性，提示需结合具体应用场景选择技术路线。

临床转化路径中，研究团队特别强调后续需开展两大关键实验：其一，将优化后的mRNA封装于脂质纳米颗粒（LNPs），验证其体外递送效率及体内保护效果；其二，建立基于感染小鼠血清的免疫原性评价体系，通过动物实验检测疫苗是否能诱导 Th1型免疫应答（分泌IFN-γ）及中和抗体产生。伦理审查已通过伊兹密尔大学动物实验委员会（编号2023-099），研究符合ARRIVE指南标准。

值得关注的是，该团队在前期工作中已积累小鼠感染模型血清数据（Karakavuk等2021），这为验证 GRA1的免疫原性提供了可靠样本库。技术路线图显示，通过pVAX1载体构建的表达系统已通过酶切鉴定和三维结构预测验证，为后续体内外研究奠定基础。研究还特别感谢Szymczak和Meis在纳米颗粒封装技术方面的指导，这暗示着与Moderna、BioNTech等机构的潜在合作可能。

在讨论部分，研究者指出现有mRNA疫苗（如新冠疫苗）多采用核苷修饰技术以提升稳定性，但本实验发现修饰反而降低表达效率，可能与真核细胞对修饰核苷的代谢机制有关。此外，poly-A尾巴长度与翻译效率的非线性关系，为mRNA设计提供了新视角——并非越长越好，需结合具体编码蛋白的翻译需求进行参数优化。

该研究为弓形虫疫苗开发开辟了新路径。目前针对弓形虫的疫苗研究多聚焦于减毒活疫苗或亚单位疫苗，而mRNA技术具备快速迭代、无需冷链（潜在）等优势。未来研究可考虑以下方向：1）构建 GRA1 联合其他弓形虫抗原的嵌合mRNA疫苗；2）开发基于mRNA的广谱疫苗平台，通过迭代替换抗原基因实现针对不同血清型弓形虫的交叉保护；3）优化 LNPs 组分（如脂质比例、辅助脂质种类）以提高疫苗递送效率。

研究局限在于体外实验未能完全模拟体内环境，特别是免疫细胞对mRNA的摄取机制。下一步计划开展灵长类动物实验，利用已建立的弓形虫感染模型评估疫苗安全性及保护效力。该成果已通过预印本平台提交，相关数据（包括未发表的 Western blot 图谱）将在GitHub开源，供学界验证和二次开发。

从技术路线图可以看出，团队采用标准化载体pVAX1，其优势在于可兼容多种mRNA设计策略。序列优化方面，采用密码子优化技术提升表达效率，并通过 CleanCap 原子化帽结构增强mRNA稳定性。这些设计细节为同类研究提供了可复用的技术模板。特别是将人类α-球蛋白UTR作为5'UTR来源，有效提升了mRNA在非人源细胞中的翻译效率，该策略可推广至其他异源抗原表达。

伦理审查和资金支持部分显示，该研究获得伊兹密尔大学科研基金（32019）资助，实验动物处理符合OECD原则。团队在致谢中特别提到与Szymczak实验室的合作，这暗示着可能将采用其开发的mRNA递送系统（如非免疫原性LC3载体），为后续研究提供技术支持。

综上，该研究在mRNA疫苗开发领域取得重要进展，首次系统验证了 GRA1蛋白在mRNA平台上的表达特性与免疫原性。虽然离临床应用仍有距离，但其揭示的mRNA优化规律（如核苷修饰与表达效率的负相关性）为疫苗设计提供了关键理论依据。随着脂质纳米颗粒技术的成熟和mRNA递送系统的持续改进，未来有望开发出针对孕妇、免疫缺陷人群的广谱弓形虫疫苗，填补这一重要公共卫生领域的空白。