线虫相关微生物群落及其对生物防治的启示：物种特异性稳态与免疫驯化机制解析

《Microbial Ecology》：Wireworm-Associated Microbial Communities and their Implications on Biological Control

本研究针对线虫难以防治及昆虫病原真菌(EPF)田间防效不稳定的问题，通过分析四种 Agriotes 线虫的微生物群落时空动态，揭示了线虫相关微生物具有物种特异性、主要源于土壤且体表微生物群落保持稳态的特征。研究发现低丰度EPF暴露可诱导线虫产生免疫驯化并提高蜕皮频率，为改进线虫生物防治策略提供了新视角。

　　

在可持续农业发展的背景下，土壤害虫的绿色防控已成为全球关注的焦点。其中，线虫——即叩甲科(Elateridae)昆虫的幼虫——是温带地区马铃薯、甜菜和玉米等作物的重要土传害虫，其生命周期可长达2至11年，给农业生产造成严重损失。传统化学杀虫剂因其对环境和健康的潜在风险而逐渐被限制使用，使得微生物杀虫剂等低风险替代方案的需求日益迫切。昆虫病原真菌(Entomopathogenic Fungi, EPF)，例如绿僵菌属(Metarhizium spp.)真菌，被认为是极具潜力的生物防治剂。然而，在实际应用中，EPF对线虫的田间防治效果常常表现出不稳定，这种波动性与作物种类、害虫物种、天气条件以及田间位点等多种因素相关。尤其值得注意的是，不同线虫物种对EPF感染的敏感性存在差异，甚至在自然环境中，线虫体内外常可检测到EPF的存在却不表现出疾病症状。这表明，除了EPF的简单存在之外，昆虫宿主与病原菌之间的相互适应、昆虫自身的免疫系统以及其体内外共生的微生物群落都可能深刻影响着感染的最终结局。为了揭示这些复杂的相互作用，并为提高线虫生物防治效率提供理论依据，由Adrian Wolfgang、Nora Temme、Ralf Tilcher、Mario Schumann和Gabriele Berg*组成的研究团队开展了一项深入研究，其成果发表在《Microbial Ecology》上。

本研究主要运用了以下关键技术方法：从奥地利和德国的田间采集四种Agriotes属线虫（A. ustulatus, A. obscurus, A. sputator, A. cf. gallicus）及其栖息土壤，建立实验室微宇宙系统进行饲养和实验；通过盐水琼脂隧道法结合洗涤液振荡分离线虫体表微生物（外共生菌），并通过液氮研磨及DNA提取试剂盒获取线虫整体DNA（用于分析内共生菌）；利用Illumina NovaSeq平台对细菌（16S rRNA基因V4区，引物515f/806r）和真菌（ITS1区，引物ITS1f/ITS2r）进行扩增子测序，并使用QIIME2和R语言进行生物信息学分析（包括α/β多样性分析、LEfSe生物标志物分析、SourceTracker2溯源分析）；通过实时定量PCR(qPCR)定量微生物负荷；并设计了免疫驯化实验，通过低剂量预暴露和高剂量挑战来评估Metarhizium不同菌株对线虫死亡率和蜕皮频率的影响。

Wireworms harbor less diverse microbial communities than soil

（线虫携带的微生物群落多样性低于土壤）

通过对土壤、线虫体表微生物（外共生菌）和体内微生物（内共生菌）的扩增子测序分析，研究人员发现，土壤的细菌和真菌群落α多样性（包括物种丰富度、均匀度和香农多样性指数）均显著高于线虫相关的样本。线虫的外共生菌与内共生菌群落组成彼此之间更为相似，但与土壤群落存在显著差异（细菌R²= 0.23, p < 0.001；真菌R²= 0.13, p < 0.001）。qPCR结果进一步证实，内共生菌的细菌和真菌绝对丰度高于外共生菌。在所有测试的线虫物种中，均普遍但低丰度（0.01-1.3%）地检测到绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的存在。

Wireworm species differ in their microbial community composition

（不同线虫物种的微生物群落组成存在差异）

研究揭示了线虫相关微生物群落的物种特异性。α多样性和β多样性分析均表明，四种Agriotes线虫的微生物群落，尤其是外共生菌群落，存在显著差异。物种因素对群落差异的解释度（R²值）在外共生菌中（细菌R²= 0.221，真菌R²= 0.232）高于内共生菌（细菌R²= 0.140，真菌R²= 0.126）。即使来自同一田间并处于相同饲养条件下的A. sputator和A. cf. gallicus，其外共生细菌群落也显著不同。通过LEfSe分析鉴定出了各线虫物种特异的生物标志物类群，例如A. cf. gallicus体表的Variovorax spp.，A. ustulatus体内的Rickettsiaceae（立克次体科）未指定物种等。真菌群落中，Trichosporon dohaense在所有线虫物种中均占主导地位。

Ectosymbiotic wireworm microbiota dynamics are stable under healthy conditions

（健康条件下线虫体表微生物群落动态保持稳定）

为了探究线虫在其漫长生命周期中体表微生物的稳定性，研究人员对A. ustulatus个体进行了长达数周的连续采样监测。结果显示，在未发生自发感染的“健康”线虫中，其体表细菌和真菌群落的香农多样性随时间推移保持相对稳定。然而，一个在实验期间因病衰竭的个体则表现出更高的多样性波动。尽管线虫体表群落与周围土壤群落始终存在显著差异，但当将线虫从原始田间土壤转移到统一的无菌盆栽土后，其体表微生物群落组成发生了显著变化，表明土壤环境是体表微生物的重要来源。

Legacy effects of soil microbiota in wireworms

（土壤微生物在线虫体内的遗留效应）

通过SourceTracker2溯源分析，研究人员评估了线虫微生物群落中源自“原始土壤”和“当前（盆栽）土壤”的比例。结果表明，大多数线虫相关微生物直接来源于当前土壤。然而，在A. ustulatus中，可以观察到先前土壤微生物群的遗留效应，例如，源自原始土壤3的细菌在外共生菌中最高可占56%，真菌在内共生菌中最高可占22%。这说明部分微生物能够在线虫体表或体内定植并持续存在，不受土壤环境完全改变的影响。

Pre-exposure to EPF affects the mortality and molting behavior of wireworms after exposure to high spore concentrations

（预暴露于EPF影响线虫在高孢子浓度下的死亡率和蜕皮行为）

免疫驯化实验的结果表明，预先用低剂量的M. robertsii处理（“免疫驯化”）影响了线虫后续面对高剂量EPF挑战时的反应。虽然预处理对M. brunneum和M. robertsii挑战组的死亡率无显著影响，但显著降低了M. anisopliae挑战组的死亡率。更为显著的影响体现在蜕皮频率上：预暴露于M. robertsii导致线虫在受到M. anisopliae和M. brunneum挑战时蜕皮频率增加，但在受到同种M. robertsii高剂量挑战时，蜕皮频率反而显著降低。这表明线虫可能采用了两种策略应对EPF威胁：免疫系统的“驯化”以及通过增加蜕皮来物理性清除附着在体表的孢子。

本研究系统解析了四种重要农业害虫线虫的微生物生态系统，得出核心结论：线虫相关微生物群落具有物种特异性，且主要来源于土壤环境；健康线虫的体表微生物群落能够保持相对稳定的动态平衡，这对于其在微生物密集的土壤环境中长期生存可能至关重要；环境中低丰度EPF的普遍存在不仅可能诱导线虫产生免疫驯化，还显著影响其蜕皮行为，这两种生理生态适应策略共同构成了线虫应对病原真菌的防御机制。这些发现深刻揭示了微生物相互作用在线虫-病原菌互作中的关键角色。研究强调，未来改进线虫的生物防治策略，必须充分考虑线虫物种间的差异、其微生物群落的稳态维持能力以及宿主自身的生理和行为适应性。同时，探索EPF与特定土壤微生物之间可能存在的功能协同效应，例如某些微生物可能通过产生抗真菌物质或降解体表化合物来抑制或促进EPF感染，将为开发新型、高效的微生物联合防治方案开辟新的途径。这项研究不仅增进了我们对土壤昆虫微生物生态学的理解，也为实现更精准、更可持续的农业害虫管理提供了重要的科学依据。