乳酸乳杆菌PRA205的基因组与蛋白水解系统解析：PepX介导的生物活性肽代谢新视角

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Genomic and Proteolytic Profiling of Lacticaseibacillus sp. PRA205: Insights into PepX-Mediated Bioactive Peptide Metabolism

本研究针对乳酸乳杆菌casei群在乳品发酵中释放生物活性肽（BPs）的遗传基础尚不明确的问题，通过多组学技术系统解析了益生候选菌株Lacticaseibacillus sp. PRA205的蛋白酶系统，首次揭示了其独特的PepX调控机制及双功能（合成/降解BPs）特性。结果表明，PRA205具备完整的蛋白酶系统（含PepX/PepQ与PepI/PepP双通路），且PepX在富肽环境中仍保持活性，其酶学特性（耐低温、酸性）支持其在发酵乳制品中精准调控BPs生成。该研究为开发功能性乳制品提供了理论依据和菌种资源。

　　

在功能性食品开发领域，乳制品发酵因其能通过微生物代谢释放具有健康促进作用的生物活性肽（Bioactive Peptides, BPs）而备受关注。乳酸乳杆菌（Lacticaseibacillus）作为公认安全（GRAS）的发酵菌株，尤其擅长水解乳蛋白生成多种BPs，如具有降压作用的Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP）。然而，不同菌株的蛋白酶活性差异显著，其遗传基础与调控机制仍不明确，限制了高产BPs菌株的精准选育。此外，脯氨酸特异性蛋白酶PepX在BPs代谢中的双重角色（合成与降解）存在争议，亟需在物种水平深入解析其功能特性。

为系统揭示乳酸乳杆菌的蛋白酶潜力，研究人员以分离自帕马森雷吉亚诺奶酪的益生候选菌株Lacticaseibacillus sp. PRA205为对象，整合基因组学、酶学与分子生物学方法，重点探究了其PepX的遗传特征、表达调控及生化功能。研究通过全基因组测序与比较基因组学明确菌株分类地位，利用抗性基因与毒力因子数据库进行生物安全性评估，并通过RT-qPCR、酶纯化与质谱分析等技术解析了pepX基因表达模式及其对BPs的降解活性。

物种鉴定与基因组特征

通过平均核苷酸一致性（ANI）与数字DNA-DNA杂交（dDDH）分析，发现PRA205与Lacticaseibacillus parahuelsenbergensis亲缘关系最近（ANIb/ANIm 97.72%/98.07%），但未能完全归属已知物种，提示其为潜在新物种。基因组大小为3.2 Mb，编码2977个基因，富含碳水化合物代谢与蛋白酶相关基因。安全性分析显示无抗生素抗性、毒力或致病基因，符合益生菌应用标准。

蛋白酶系统重构

PRA205具备完整的蛋白酶系统，包括细胞表面蛋白酶PrtR1、多种肽转运体及细胞内肽酶。值得注意的是，其拥有两条降解富脯氨酸酪蛋白的独立通路：PepX/PepQ（水解X-Pro二肽）和PepI/PepP（水解Pro-X肽键）。与多数蛋白酶基因受肽富集环境抑制不同，pepX基因在MRS培养基中仍持续表达，在牛奶中显著上调，表明其调控可能部分独立于氨基酸可用性信号。

PepX酶学特性与功能验证

PepX为单体丝氨酸蛋白酶（约80 kDa），最适pH 7.0，在酸奶发酵温度（42°C）和冷藏条件（5°C）下仍保留77%和47%的活性，且在pH 4.5时活性达40%，适用于乳品发酵与储存环境。抑制剂实验证实其对PMSF敏感，依赖金属离子。进一步研究发现，PepX可降解多种BPs，包括降压肽VPP、IPP和抗糖尿病肽LPPT、APFPE等，但对IPP的降解率最低，提示其对不同肽序列的选择性。

研究结论与意义

本研究首次在Lacticaseibacillus属中系统阐明了PRA205的蛋白酶遗传基础，揭示了PepX在BPs代谢中的双功能角色：既参与肽链加工释放BPs，又能降解已生成的BPs。其耐酸、耐低温特性及部分脱离氮源调控的表达模式，使其在发酵乳制品中具备持续调控肽谱的潜力。这些发现为开发富含特定BPs的功能性乳制品提供了理论支撑，并凸显了PRA205作为优良发酵剂的应用前景。

（论文发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》）