揭示ZNF384-INTS13-hnRNPC轴作为宫颈癌治疗新靶点

《Cell Death & Disease》：Unveiling the ZNF384-INTS13-hnRNPC axis as a therapeutic vulnerability in cervical cancer

宫颈癌治疗面临靶点匮乏、疗效局限等挑战。本研究聚焦整合子复合体亚基13（INTS13），通过多组学分析、功能实验及动物模型，证实INTS13在宫颈癌中高表达且与不良预后相关。研究发现转录因子ZNF384直接调控INTS13表达，而INTS13通过下游效应分子hnRNPC促进肿瘤恶性进展，由此揭示ZNF384-INTS13-hnRNPC信号轴可作为宫颈癌的潜在治疗靶点，为开发新型疗法提供理论依据。

　　

宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一，尤其在中低收入国家仍构成重大公共卫生负担。尽管人乳头瘤病毒（HPV）疫苗接种和筛查项目已取得进展，但晚期或复发性宫颈癌患者的预后仍然较差。当前的标准治疗方案，包括根治性手术、放疗和全身化疗，往往因缺乏特异性而导致全身毒性，并面临获得性耐药的问题。虽然靶向治疗和免疫检查点抑制剂（如帕博利珠单抗）等新型疗法展现出潜力，但其应用仍受限于耐药性、患者反应异质性以及缺乏可靠的预测性生物标志物。因此，鉴定和验证新的分子靶点对于开发更有效的宫颈癌治疗策略至关重要。

本研究主要运用了以下关键技术方法：利用癌症基因组图谱（TCGA）和公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据库（包括来自ArrayExpress的E-MTAB-11948数据集）进行生物信息学分析；从手术患者（样本量n=20）获取宫颈癌组织及配对癌旁组织，并分离培养原代宫颈癌细胞（pCCa-1, pCCa-2, pCCa-3）和原代宫颈上皮细胞（priCEpi-1, priCEpi-2）；通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）进行基因沉默，利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除（KO），以及通过慢病毒载体进行基因过表达；采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验检测细胞增殖，Transwell小室实验评估细胞迁移和侵袭能力，膜联蛋白V染色/末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色、Caspase活性检测、JC-1染色（检测线粒体膜电位）和细胞色素c酶联免疫吸附试验（ELISA）评估细胞凋亡，蛋白质印迹法（Western Blot）和免疫组织化学（IHC）分析蛋白表达，染色质免疫沉淀（ChIP）实验验证转录因子结合，并利用裸鼠异种移植瘤模型进行体内功能验证。

3.1. INTS13在宫颈癌中高表达并预示不良预后

对TCGA数据的分析显示，与癌旁组织相比，INTS13在宫颈癌组织中的表达显著升高，且在腺癌（AC）、鳞状细胞癌（SCC）和腺鳞癌（ASC）等多种组织学亚型中均呈现高表达，其中SCC的上调最为明显。INTS13的高表达与肿瘤T分期（肿瘤原发灶浸润深度）进展显著相关，但在N分期（淋巴结转移）和M分期（远处转移）上未见显著差异。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明INTS13对宫颈癌具有较高的诊断价值。生存分析显示，高表达INTS13的患者总生存期更短，这种不良预后关联在腺癌和鳞癌亚型中均存在。有趣的是，INTS13的表达与患者体重指数（BMI）呈负相关，且其对预后的负面影响在BMI较高的患者亚组中更为显著。

3.2. 单细胞分析揭示INTS13在宫颈鳞癌上皮细胞中高表达并关联关键通路

对宫颈鳞癌单细胞RNA测序数据的分析精确揭示了肿瘤微环境中的细胞组成，并发现INTS13主要在上皮细胞簇中高表达，且癌组织上皮细胞中的表达显著高于癌旁组织。对与INTS13共表达基因的功能富集分析表明，这些基因显著富集于RNA剪接、RNA加工、氧化磷酸化（OXPHOS）和线粒体电子传递链等关键细胞过程，提示INTS13可能在这些过程中发挥重要调控作用。

3.3. 临床样本和细胞系验证INTS13高表达

在手术切除的20对临床样本中，宫颈癌组织的INTS13 mRNA和蛋白水平均显著高于配对癌旁组织。同时，HPV16/18 E6癌蛋白在癌组织中高表达。在原代宫颈癌细胞（pCCa-1, pCCa-2, pCCa-3）和HeLa细胞系中，INTS13的表达也显著高于原代宫颈上皮细胞，进一步证实了其在宫颈癌中的特异性高表达。

3.4. 抑制INTS13减弱宫颈癌细胞恶性表型

在原代pCCa-1细胞中使用三种不同的shRNA（shINTS13-Sq1, Sq2, Sq3）有效敲低INTS13后，细胞的活力、增殖（EdU阳性率）、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均受到显著抑制。这种抑制效应在其他原代宫颈癌细胞（pCCa-2, pCCa-3）和HeLa细胞中也得到验证。

3.5. 抑制INTS13诱导宫颈癌细胞特异性凋亡

在pCCa-1细胞中敲低INTS13后，Caspase-3和Caspase-9活性增强，PARP和Caspase-3剪切增加，胞浆细胞色素c水平升高，线粒体膜电位下降，TUNEL阳性细胞和总细胞死亡比例增加。广谱Caspase抑制剂z-VAD-fmk和Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk可逆转INTS13敲低引起的细胞死亡。同样，在pCCa-2, pCCa-3和HeLa细胞中敲低INTS13也诱导了凋亡。重要的是，在原代宫颈上皮细胞中敲低INTS13并未引起凋亡，表明INTS13沉默对癌细胞的促凋亡作用具有选择性。

3.6. 基因敲除INTS13证实其促癌功能

利用CRISPR/Cas9技术构建INTS13敲除（koINTS13-sg1, koINTS13-sg2）的pCCa-1细胞，证实基因敲除同样能抑制细胞活力、增殖、迁移和侵袭，并诱导线粒体膜电位丧失和细胞凋亡。

3.7. 过表达INTS13增强宫颈癌细胞恶性表型

在pCCa-1细胞中过表达INTS13（oeINTS13-Slc1, oeINTS13-Slc2）后，细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力均显著增强。这一结果在pCCa-2, pCCa-3和HeLa细胞中得到重复验证。

3.8. hnRNPC是INTS13的下游效应分子

通过整合TCGA转录组、DepMap蛋白质组和单细胞测序数据的共表达分析，发现异质核核糖核蛋白C（hnRNPC）是共同的关键分子。TCGA数据显示hnRNPC与INTS13表达呈正相关。功能实验证实，在pCCa-1细胞中敲低或敲除INTS13会降低hnRNPC的mRNA和蛋白水平，而过表达INTS13则上调hnRNPC。更重要的是，在INTS13沉默的细胞中恢复hnRNPC的表达，可以逆转由INTS13敲低导致的增殖抑制、迁移能力下降和凋亡增加。这表明hnRNPC是介导INTS13促癌作用的关键下游效应器。

3.9. 转录因子ZNF384直接调控INTS13表达

通过生物信息学工具（JASPAR2022等）预测并结合实验验证，发现锌指蛋白384（ZNF384）是调控INTS13表达的关键转录因子。在pCCa-1细胞中，敲低ZNF384会降低INTS13的表达，而过表达ZNF384则上调INTS13。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证明，ZNF384直接结合到INTS13的启动子区域，且这种结合在原代宫颈癌细胞和临床宫颈癌组织中显著强于正常上皮细胞或癌旁组织。

3.10. 体内实验证实靶向INTS13抑制肿瘤生长

在裸鼠皮下移植瘤模型中，注射稳定表达shINTS13-Sq3的pCCa-1细胞，其肿瘤生长速度、最终肿瘤体积和重量均显著低于对照组。对瘤组织的分析显示，shINTS13-Sq3组肿瘤中INTS13和hnRNPC的表达下调，细胞增殖标志物Ki67阳性率降低，而凋亡相关指标（胞浆细胞色素c、活化的Caspase-9和Caspase-3、TUNEL阳性细胞）增加，体内结果与体外发现一致。

本研究系统性地揭示了INTS13在宫颈癌中的致癌作用及其分子机制。研究发现INTS13在宫颈癌中高表达，与不良预后相关，并通过体外和体内实验证明其促进癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡。机制上，转录因子ZNF384直接正向调控INTS13的表达，而INTS13通过调控下游效应分子hnRNPC来发挥其促癌功能，从而确立了ZNF384-INTS13-hnRNPC信号轴。这一新发现的信号通路不仅深化了对宫颈癌发病机制的理解，更重要的是为开发针对该轴的新型靶向治疗策略提供了强有力的理论依据和潜在的干预靶点，对于改善宫颈癌患者预后具有重要意义。