RIPK1非经典功能驱动胶质母细胞瘤恶性进展及替莫唑胺增敏作用研究

《Cell Death & Disease》：Necroptotic signaling orchestrates glioblastoma malignancy and potentiates temozolomide response

胶质母细胞瘤(GBM)对替莫唑胺(TMZ)耐药是临床治疗的主要障碍。本研究聚焦程序性坏死(necroptosis)通路，发现RIPK1和MLKL高表达与患者不良预后相关。研究揭示RIPK1通过非激酶依赖方式促进肿瘤增殖和侵袭，而联合应用TMZ与坏死诱导剂ZZW115或香茅醇(citronellol)可显著增强体内外抗肿瘤效果，为克服TMZ耐药提供了新策略。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其治疗一直是神经外科领域的巨大挑战。尽管标准治疗方案包括最大程度的安全手术切除，辅以放疗和化疗，但患者的预后依然极差，中位总生存期仅为8个月左右。替莫唑胺(TMZ)作为一线化疗药物，虽然能穿过血脑屏障，但超过一半的患者最终会产生耐药性，导致治疗失败。因此，深入理解GBM的恶性进展机制，并寻找克服TMZ耐药的新策略，是当前临床亟待解决的关键问题。

在GBM的病理特征中，肿瘤内部坏死灶的积累是一个显著标志。这种坏死与程序性坏死(necroptosis)的激活密切相关。程序性坏死是一种受调控的细胞死亡形式，其经典通路由受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)介导。然而，这一通路在GBM中究竟扮演着“朋友”还是“敌人”的角色，其具体功能和生物学意义尚不完全清楚。为了回答这些问题，来自复旦大学、温州医科大学附属第一医院等机构的研究团队在《Cell Death & Disease》上发表了最新研究成果，揭示了RIPK1在驱动GBM恶性进展中的关键作用，并提出了通过诱导程序性坏死来增强TMZ疗效的新策略。

关键实验方法

本研究综合利用了生物信息学分析、临床样本验证、体外细胞功能实验和体内动物模型验证等多种技术手段。研究人员首先从TCGA、CGGA和CPTAC等公共数据库中获取了胶质瘤的转录组和蛋白质组数据，分析了RIPK1、RIPK3和MLKL的表达与患者预后的关系。同时，研究团队收集了81例临床胶质瘤样本（包括WHO II级、III级和IV级）进行蛋白质印迹(Western blot)和免疫组化验证。在体外实验中，利用CRISPR-Cas9技术构建了RIPK1和MLKL敲除的胶质瘤细胞系，通过CCK-8、集落形成、Transwell迁移和侵袭实验评估了基因敲除对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。此外，还通过RNA测序(RNA-seq)分析了RIPK1敲除后的基因表达谱变化。在体内实验中，研究人员建立了皮下异种移植瘤模型和原位胶质瘤小鼠模型，通过生物发光成像技术评估了TMZ联合程序性坏死诱导剂（ZZW115和香茅醇）的治疗效果。

研究结果

RIPK1和MLKL高表达与胶质瘤恶性进展及不良预后相关

研究人员首先分析了TCGA和GTEx数据库，发现与正常脑组织相比，RIPK1和RIPK3的mRNA在II-IV级胶质瘤中均显著上调。在CGGA数据集中，RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA水平也随着胶质瘤级别的升高而增加。值得注意的是，在IDH野生型（通常预后更差）的胶质瘤中，这三个基因的表达水平显著高于IDH突变型肿瘤。对81例临床胶质瘤样本的蛋白质印迹分析进一步证实，RIPK1和MLKL的蛋白水平在IV级胶质母细胞瘤中显著高于低级别胶质瘤，且IDH野生型肿瘤中RIPK1和MLKL的蛋白水平也更高。生存分析显示，在TCGA和CGGA队列中，RIPK1、RIPK3和MLKL的高表达是胶质瘤患者总体生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)和无进展生存期(PFI)的独立危险因素。临床样本的免疫印迹分析也证实，RIPK1和MLKL蛋白高表达的患者生存期更短。这些结果表明，程序性坏死通路的关键分子与胶质瘤的恶性进展和不良预后密切相关。

RIPK1和MLKL驱动胶质瘤细胞增殖和肿瘤形成

为了探究RIPK1和MLKL的功能，研究人员发现，在临床样本中，Ki67（细胞增殖标志物）高表达的肿瘤，其RIPK1和MLKL的蛋白水平也显著更高。在体外实验中，利用CRISPR-Cas9技术敲除RIPK1或MLKL后，U251胶质母细胞瘤细胞的增殖能力和集落形成能力均受到显著抑制。进一步分析TCGA数据发现，RIPK1的表达与细胞周期蛋白E1(CCNE1)、CDK2以及上皮间质转化(EMT)相关基因（如N-钙黏蛋白）的表达呈正相关。蛋白质印迹分析显示，敲除RIPK1或MLKL会下调细胞周期蛋白A2、B1和E1的表达，而过表达RIPK1或MLKL则能恢复这些蛋白的水平。在体内实验中，将RIPK1或MLKL敲除的U251细胞皮下注射到裸鼠体内后，无法形成肿瘤，而野生型细胞则能形成明显的肿瘤。这些结果证明，RIPK1和MLKL是胶质瘤细胞增殖和肿瘤形成所必需的。

RIPK1通过非激酶依赖方式促进细胞周期进程

既然RIPK1的缺失抑制了细胞增殖，那么其激酶活性是否发挥了作用？研究人员发现，使用RIPK1激酶抑制剂necrostatin-1(Nec-1)或MLKL寡聚化抑制剂necrosulfonamide(NSA)处理U251细胞，并不能抑制细胞生长。这表明RIPK1促进胶质瘤增殖的作用不依赖于其激酶活性。在RIPK1敲除的细胞中重新表达RIPK1，能够恢复细胞周期蛋白A2、B1和E1的表达，并挽救细胞增殖和集落形成能力。流式细胞术分析进一步证实，敲除RIPK1会导致U251和A172胶质瘤细胞发生S期和G2/M期阻滞。这些结果表明，RIPK1通过一种非激酶依赖的方式，通过维持细胞周期蛋白的表达来促进胶质瘤细胞的增殖。

RIPK1通过调控EMT和ECM促进胶质瘤细胞迁移和侵袭

研究人员通过Transwell实验发现，敲除RIPK1显著抑制了U251细胞的迁移和侵袭能力，而敲除MLKL则没有明显影响。在RIPK1敲除的细胞中重新表达RIPK1，可以恢复其迁移和侵袭能力。蛋白质印迹分析显示，敲除RIPK1会降低N-钙黏蛋白（EMT的标志物）的表达，而过表达RIPK1则会增加其表达。为了深入探究其分子机制，研究人员对野生型和RIPK1敲除的U251细胞进行了RNA测序分析。差异表达基因分析发现，RIPK1敲除后，有175个基因下调，553个基因上调。通路富集分析显示，下调的基因主要富集在细胞外基质(ECM)组织和胶原形成等通路中。这些结果表明，RIPK1通过促进EMT和调控细胞外基质来驱动胶质瘤的侵袭性。

诱导程序性坏死可增敏胶质瘤对替莫唑胺的治疗反应

替莫唑胺(TMZ)是GBM的一线化疗药物，但其耐药性限制了其疗效。研究人员测试了两种程序性坏死诱导剂——ZZW115和香茅醇(citronellol)在胶质瘤细胞中的作用。结果显示，ZZW115和香茅醇在U251和U87细胞中的IC₅₀值远低于TMZ，表明它们具有更强的细胞毒性。蛋白质印迹分析显示，TMZ主要激活caspase-9并诱导细胞凋亡，而ZZW115和香茅醇则能增加p-MLKL（程序性坏死的标志）的水平。更重要的是，将TMZ与ZZW115或香茅醇联合使用时，能显著增强对U251细胞的杀伤作用。在体内原位胶质瘤模型中，TMZ联合ZZW115或香茅醇治疗，相比TMZ单药治疗，能更有效地清除肿瘤，且对小鼠体重没有显著影响。这些结果表明，通过诱导程序性坏死，可以克服胶质瘤对TMZ的耐药性，显著提高治疗效果。

研究结论与意义

本研究系统性地揭示了程序性坏死通路在胶质母细胞瘤中的双重角色。一方面，该通路的关键分子RIPK1和MLKL作为癌基因，其高表达与肿瘤的恶性进展和患者的不良预后密切相关。RIPK1通过一种非激酶依赖的方式，调控细胞周期蛋白的表达，促进肿瘤细胞增殖；同时，它还通过调控上皮间质转化(EMT)和细胞外基质(ECM)重塑，驱动肿瘤的侵袭和转移。另一方面，该通路又可以被药物激活，作为一种有效的细胞死亡机制，用于清除对传统化疗药物耐药的肿瘤细胞。

这项研究不仅阐明了RIPK1在胶质瘤恶性进展中的新功能，更重要的是，它提出了一种全新的治疗策略：通过联合应用TMZ和程序性坏死诱导剂（如ZZW115或香茅醇），可以协同诱导肿瘤细胞死亡，从而克服TMZ耐药，显著提高治疗效果。这一发现为开发新的胶质瘤联合治疗方案提供了坚实的理论基础和实验依据，具有重要的临床转化前景。