PIPI-C：基于混合整数线性规划模型，无偏鉴定多修饰肽段以揭示癌症相关翻译后修饰热点

《Molecular & Cellular Proteomics》：PIPI-C: A combinatorial optimization framework for identifying post-translational modification hot-spots in mass spectrometry data

本研究针对质谱数据中多修饰肽段鉴定这一NP难组合优化问题，开发了PIPI-C（PTM-Invariant Peptide Identification with a Combinatorial model）搜索引擎。该工具通过构建混合整数线性规划（MILP）模型，克服了现有方法在处理高阶PTM组合时的局限性。研究团队在多种数据集上验证了PIPI-C的优越性能，并将其应用于超过7200万张人类癌症（LSCC、COAD、GBM）质谱图，成功揭示了显著上调的PTM组合，为解码复杂PTM模式提供了强大的数学框架，并增进了对疾病中PTM驱动细胞过程的理解。

　　

在生命科学领域，蛋白质是生命活动的执行者，而蛋白质的功能不仅由其氨基酸序列决定，更受到翻译后修饰（PTM）的精细调控。这些修饰如同给蛋白质贴上了“标签”，可以改变其活性、定位和相互作用，从而调控几乎所有的细胞过程。然而，蛋白质的修饰并非孤立存在，它们之间存在着复杂的“对话”，即PTM crosstalk。当多个PTM在蛋白质的相邻区域密集出现时，便形成了所谓的“PTM热点”，这些热点是PTM crosstalk发生的关键区域，与多种人类疾病，特别是癌症的发生发展密切相关。

尽管PTM crosstalk的重要性日益凸显，但要从海量的质谱数据中准确鉴定出携带多个PTM的肽段，却是一个巨大的挑战。这本质上是一个组合优化问题，其计算复杂度随着PTM数量的增加呈指数级增长，属于NP难问题。现有的质谱数据库搜索方法，如Mascot和Comet，通常只能处理预先指定的、数量有限的几种PTM，无法应对自然界中超过200种已知PTM的复杂组合。而一些开放搜索方法虽然有所改进，但在处理高阶PTM组合时，其性能往往依赖于从谱图中提取的“标签”的准确性，或者受限于计算复杂度，难以同时定位多个PTM。

为了攻克这一难题，来自香港科技大学的研究团队开发了一款名为PIPI-C（PTM-Invariant Peptide Identification with a Combinatorial model）的新型搜索引擎。该工具的核心创新在于，它将多修饰肽段的鉴定问题构建为一个混合整数线性规划（MILP）模型。通过这一数学框架，PIPI-C能够同时确定肽段的序列和PTM模式，从而找到与实验质谱图最匹配的理论肽段，为解码复杂的PTM模式提供了一个强大且理论上保证最优解的解决方案。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   质谱数据来源：研究使用了多种来源的质谱数据，包括模拟数据集、合成数据集、大豆数据集、矮牵牛数据集以及人类癌症队列数据，其中人类癌症数据包括来自CPTAC的肺鳞状细胞癌（LSCC）、结直肠腺癌（COAD）和胶质母细胞瘤（GBM）队列。
2. 2.
   模糊双向匹配：利用FM-index（全文索引）技术，结合模糊和双向匹配策略，从蛋白质数据库中高效地检索候选肽段，提高了候选肽段检索的灵敏度和准确性。
3. 3.
   混合整数线性规划（MILP）模型：构建了一个新颖的MILP模型，将肽段序列和PTM模式的鉴定问题转化为一个数学优化问题，旨在最大化理论谱图与实验谱图之间的匹配度，并利用Gurobi等求解器进行求解。
4. 4.
   生物信息学分析：对鉴定结果进行了全面的生物信息学分析，包括差异表达分析、基序（Motif）分析、基因本体（GO）富集分析以及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以揭示PTM在癌症中的生物学意义。

研究结果

1. 性能验证：PIPI-C在多种数据集上表现优异

为了评估PIPI-C的性能，研究团队在模拟数据集、合成数据集、大豆数据集和矮牵牛数据集上，将其与Open-pFind和MODplus等现有领先工具进行了比较。

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  模拟数据集验证：在信噪比（SNR）为2.023的模拟数据集中，PIPI-C正确鉴定了超过99%的肽段骨架，而Open-pFind和MODplus分别为42%和92%。在PTM表征方面，PIPI-C的精度达到85%，显著高于Open-pFind（65%）和MODplus（76%）。更重要的是，PIPI-C在处理携带两个以上PTM的肽段时表现出明显优势，而其他工具的性能则随着PTM数量的增加而急剧下降。
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  合成数据集验证：在包含21个合成数据集的测试中，PIPI-C在肽段骨架和PTM鉴定的灵敏度上均优于竞争对手。例如，在包含Phospho@Y（酪氨酸磷酸化）的数据集中，PIPI-C鉴定的PSM数量分别比Open-pFind和MODplus高出7%和15%。
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  大豆数据集验证：在大豆数据集上，PIPI-C鉴定出的完全二甲基化标记的肽段数量分别比Open-pFind和MODplus高出75%和17%，且错误率控制在较低水平。
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  矮牵牛数据集验证：在矮牵牛数据集上，PIPI-C成功鉴定出大量PTM组合，包括一个三PTM组合（GG@K、Phe→Cys@F和Unknown: 248@N-term）。通过交叉验证发现，许多PIPI-C鉴定出的PTM组合，在Open-pFind和MODplus中无法被检测到，除非将这些PTM预先指定为可变修饰进行搜索，这证明了PIPI-C在无偏鉴定PTM组合方面的强大能力。

2. 在肺鳞状细胞癌（LSCC）中的应用

研究团队将PIPI-C应用于一个包含超过2.21亿张MS2谱图的LSCC数据集（LSCC1）。在肽段水平FDR<0.01的严格标准下，PIPI-C共鉴定了超过106万个PSM，其中超过50%携带了除TMT标签外的PTM。

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  差异表达分析：通过定量分析，研究发现了860个显著上调的独特PTM位点模式（UPSP），其中约50%的UPSP携带至少两个PTM，表明在LSCC中存在广泛的潜在PTM crosstalk。
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  基序分析：对上调的磷酸化位点进行基序分析，发现了p[S/T]PK、p[S/T]P和[S]xp[S/T]等显著富集的基序。
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  GO富集分析：GO分析揭示了与肺功能和呼吸系统相关的生物学过程、细胞组分和分子功能的显著上调，如血红蛋白α结合、蛋白质结合、二氧化碳转运、氧转运等。其中，细胞外囊泡（extracellular vesicle）的富集具有极高的显著性。
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  PPI网络分析：对上调UPSP对应的蛋白质进行PPI网络分析，发现了两个显著的相互作用组，其中许多蛋白质已被报道与肺癌相关，如ZYX、ACTG1和MYH9。

3. 在结直肠腺癌（COAD）中的应用

研究团队还将PIPI-C应用于一个包含超过9500万张MS2谱图的COAD数据集（COAD1）。

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  鉴定结果：PIPI-C共鉴定了超过528万个PSM，其中约44%携带了PTM。定量分析发现了300个显著上调的UPSP，其中约26%携带至少两个PTM。
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  基序分析：对上调的脱酰胺化位点（Deamidation@N）进行基序分析，发现了Gd[N]、d[N]xxA和d[N]xE等显著富集的基序。
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  GO富集分析：GO分析揭示了31个显著上调的生物学过程、74个细胞组分和21个分子功能，如I型胶原三聚体、IgG免疫球蛋白复合物、突触后细胞骨架组织和NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物等，其中许多与结肠癌的发生发展相关。

4. 在胶质母细胞瘤（GBM）中的应用

为了验证PIPI-C在非标记数据上的性能，研究团队将其应用于两个独立的GBM队列（GBM1和GBM2）。结果显示，PIPI-C在两个队列中分别鉴定了超过214万和109万个PSM，其中分别有约54%和73%携带PTM。两个队列的UPSP交集分别为23%和19%，证明了PIPI-C在不同来源数据上的稳健性。

结论与讨论

本研究开发了PIPI-C，一个基于混合整数线性规划（MILP）模型的组合优化框架，用于从质谱数据中无偏地鉴定携带多个PTM的肽段。通过将复杂的肽段鉴定问题构建为MILP模型，PIPI-C能够同时确定肽段序列和PTM模式，从而找到最优解。

研究通过多种数据集的验证，证明了PIPI-C在肽段骨架鉴定和PTM表征方面均优于现有的领先工具，特别是在处理携带多个PTM的肽段时表现出显著优势。更重要的是，PIPI-C能够发现现有方法难以检测到的PTM组合，为研究PTM crosstalk提供了强大的工具。

将PIPI-C应用于人类癌症（LSCC、COAD、GBM）的大规模质谱数据，研究揭示了大量显著上调的PTM组合，其中许多组合携带两个或更多PTM，表明PTM crosstalk在癌症中可能扮演着重要角色。这些发现为理解癌症的分子机制提供了新的线索，并可能为未来的诊断和治疗策略提供潜在的靶点。

总之，PIPI-C为解码复杂的PTM模式提供了一个强大、稳健且理论上保证最优解的数学框架，极大地推动了PTM crosstalk研究的发展，增进了我们对疾病中PTM驱动细胞过程的理解。该研究已发表在《Molecular & Cellular Proteomics》期刊上。