第四代iGluSnFR荧光探针：具有定制化失活动力学的超高灵敏度谷氨酸指示器

《Nature Methods》：Glutamate indicators with increased sensitivity and tailored deactivation rates

本研究针对现有谷氨酸荧光指示剂iGluSnFR3在信噪比和成像速度方面的局限性，开发了第四代iGluSnFR变体iGluSnFR4f（快速失活）和iGluSnFR4s（慢速失活）。通过大规模组合突变筛选和体内外功能验证，新变体显著提高了检测灵敏度（单囊泡释放事件检测能力）和时空分辨率，成功应用于视觉皮层、体感皮层、海马和中脑等多个脑区的突触传递成像，为解析神经信息处理机制提供了强大工具。

　　

大脑如同一个精密的网络，神经元通过数千个输入突触接收信息，而谷氨酸是大脑中最主要的兴奋性神经递质。理解神经元如何整合这些突触输入信号，是揭示大脑信息处理机制的关键。然而，由于单个突触囊泡释放的谷氨酸分子数量少、停留时间短，实时监测大量突触的谷氨酸释放动态一直是个巨大挑战。

虽然基因编码的谷氨酸指示剂iGluSnFR的出现为研究突触传递带来了希望，但即使是最先进的iGluSnFR3变体，其信噪比和成像速度仍难以满足同时记录大量突触活动的需求。当需要同时监测更多突触时，有限的激发激光功率需要被分散，导致每个突触的信噪比下降。此外，显微镜的有限成像速度也限制了研究人员在时间分辨率与监测突触数量之间的权衡——要想以足够高的帧率捕捉iGluSnFR3的快速信号（衰减时间常数小于30毫秒），传统双光子显微镜只能同时监测几十个突触。

针对这些挑战，发表在《Nature Methods》上的这项研究成功开发了两种高度敏感的第四代iGluSnFR变体：iGluSnFR4f（快速失活）和iGluSnFR4s（慢速失活）。这些新探针不仅灵敏度显著提高，还能在活体大脑中检测到单个囊泡释放事件，为研究神经信息处理提供了强大工具。

研究人员采用了多层次的技术策略来开发和验证新探针。首先，他们在iGluSnFR3的基础上，对41个关键位点进行饱和突变筛选，测试了1640种变体在大鼠原代皮层神经元中的表达和功能。接着，他们通过光学微型事件（自发突触释放）检测，从70种候选变体中筛选出性能最优者。最后，通过双光子显微镜和小鼠视觉皮层在体成像，以及中脑光纤光度法记录，全面评估了优选变体的性能。研究还解析了iGluSnFR3的晶体结构（PDB: 9FBU），为理解突变效应提供了结构基础。实验动物包括C57BL/6J等品系的小鼠，部分实验使用了E18大鼠海马神经元原代培养模型。

培养神经元场刺激筛选

研究人员通过系统性的蛋白质工程方法，对iGluSnFR3的41个关键位点进行饱和突变筛选，获得了1640种变体。在原代皮层神经元中表达这些变体后，他们通过电场刺激诱发单个动作电位，测量了各变体的基线荧光亮度（F₀）、峰值响应（ΔF/F₀）及上升和衰减时间。从中选出12个单点突变后，构建了包含1728种变体的组合库。广义线性模型（GLM）分析显示，位点间存在显著的交互作用，且交互作用强度与残基间的空间距离负相关。

光学微型事件筛选

通过记录TTX（河豚毒素）沉默处理的神经元中自发突触谷氨酸释放（光学微型事件），研究人员评估了70种优选变体。光学微型事件反映了单个突触囊泡的异步释放，其空间范围小、动力学更快，适合筛选具有快速衰减动力学和高信噪比的变体。表现最佳的变体v8880（即iGluSnFR4s）的信噪比比iGluSnFR3高4.7倍，而v9601（即iGluSnFR4f）的信噪比提高2.1倍，衰减速度快3.2倍。

小鼠视觉皮层筛选与iGluSnFR4s和iGluSnFR4f的选定

在体实验中，研究人员将七种优选变体稀疏标记到小鼠初级视觉皮层（V1）的第2/3层锥体神经元树突，通过呈现周期性全视野光闪视觉刺激来评估各变体性能。基于信噪比、可检测性、基线荧光和光漂白等指标，最终选定v8880和v9601作为最佳慢速和快速衰减变体，分别命名为iGluSnFR4s和iGluSnFR4f。重要的是，表达这些探针未影响树突棘的存活率。

iGluSnFR4在视觉皮层检测突触谷氨酸

通过单细胞电穿孔在V1神经元中稀疏表达iGluSnFR3、iGluSnFR4s和iGluSnFR4f，并结合松散细胞贴附记录和双光子成像，研究人员表征了单个动作电位诱发的轴突终扣谷氨酸瞬变。iGluSnFR4f和iGluSnFR4s的单动作电位诱发幅度显著大于iGluSnFR3。iGluSnFR4f的衰减时间常数（中位数25.9毫秒）快于iGluSnFR3（29.1毫秒），而iGluSnFR4s则慢得多（152.7毫秒）。在朝向选择性漂移光栅刺激下，两种新变体均能在树突棘上记录到高信噪比、方位选择性的响应，且iGluSnFR4f具有更高的时间锐度和空间特异性。

桶状皮层第4层中的频率响应表征

在桶状皮层（vS1）中表达iGluSnFR变体，并通过自适应光学双光子（AO-2P）显微镜记录丘脑皮质轴突在节律性气流刺激（2-30赫兹）和自由触须摆动期间的谷氨酸信号。iGluSnFR4f在所有频率下均表现出最高的调制深度，并能检测到高达20赫兹的刺激，超过了小鼠自然摆动频率。在自由触须摆动实验中，iGluSnFR4f能清晰分辨快速连续接触事件，而iGluSnFR4s对快速重复事件的响应分辨较差。

第5层神经元簇状树突中的慢帧率成像

在双光子成像中，成像速度与视野范围之间存在权衡。研究人员在V1第5层神经元顶树突中表达iGluSnFR变体，并呈现稀疏噪声视觉刺激。通过拟合时空感受野（stRF），发现iGluSnFR4s解释的方差是iGluSnFR3的四倍（中位数18.3%对4.5%），每个树突上产生的响应位点数量是iGluSnFR3的九倍多。

iGluSnFR4s的高灵敏度光纤光度法

光纤光度法整合了所有标记膜的信号，因此受益于高亲和力、慢速衰减的指示剂。在腹侧被盖区（VTA）GABA能神经元中表达iGluSnFR4s、iGluSnFR3或SF-iGluSnFR，并在给予水奖励时记录信号。iGluSnFR4s对奖励的响应幅度显著大于其他两种指示剂，证明了其在光度法应用中的高性能。

本研究成功开发了具有高灵敏度、快速激活及定制化失活动力学的第四代iGluSnFR变体。iGluSnFR4f适合追踪快速释放间隔，具有更高的时间分辨率和空间特异性；而iGluSnFR4s则因更大的时间积分光子数和信噪比，更适用于检测释放事件，尤其在慢速成像和光纤光度法中表现卓越。这两种探针均能高特异性地报告活体中单个突触的信号，其中iGluSnFR4f的空间特异性略高于iGluSnFR4s。

重要的是，iGluSnFR4变体信噪比的提升对于观察单囊泡释放、记录更大突触群体以及其他挑战性应用至关重要。记录更大规模的突触输入对于研究单个神经元如何整合数千个兴奋性突触在毫秒时间尺度上的输入输出操作至关重要。这些工具将推动对神经计算、突触生理学及脑疾病机制的新研究。

该研究通过神经元培养和活体实验筛选适用于单个释放事件响应的探针，强调了应用导向筛选的重要性。组合筛选在12个突变位点的高维序列空间中密集采样，揭示了众多非线性相互作用，为超越本工作的指示剂工程提供了宝贵资源。研究还证实，在膜展示载体方面，NGR载体在活体测试中匹配或优于PDGFR，推荐在大多数应用中使用。

总之，iGluSnFR4s和iGluSnFR4f解决了在体记录大规模单个突触输入和快速突触动力学的关键挑战，为神经科学研究者提供了强大工具，有望在神经元计算、突触生理学和脑疾病机制等领域催生新的突破性发现。