RICH1通过TRIM21介导RhoA泛素化降解抑制STAT3磷酸化促进乳腺癌中促炎性TAM浸润

《npj Precision Oncology》：RICH1 enhances pro-inflammatory TAM infiltration in breast cancer via promoting TRIM21-mediated ubiquitination of RhoA and inhibiting STAT3 phosphorylation

为解决乳腺癌免疫治疗敏感性不足及肿瘤微环境（TME）异质性难题，本研究聚焦极性蛋白RICH1在调控肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化中的作用。研究发现，RICH1通过结合TRIM21促进RhoA泛素化降解，抑制STAT3磷酸化，从而上调IFN-γ分泌，诱导M1样TAM极化，重塑免疫抑制微环境。该研究揭示了RICH1作为免疫相关生物标志物的潜力，为联合免疫治疗策略提供了新靶点。

　　

论文解读

在乳腺癌的治疗领域，免疫疗法已成为继传统放化疗之后的一把利器。然而，并非所有患者都能从中获益，其疗效在很大程度上受制于肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的“冷热”状态。其中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）作为TME中最主要的免疫细胞，扮演着“双面间谍”的角色：它们既可以发挥抗肿瘤的“M1”促炎功能，也可以转变为促进肿瘤生长和转移的“M2”抑炎表型。因此，如何将TAMs从“助纣为虐”的M2型“策反”为“大义灭亲”的M1型，是当前肿瘤免疫研究的热点。

既往研究多关注于免疫细胞自身的调控机制，而肿瘤细胞如何通过分泌信号分子来“遥控”TAMs的极化状态，其内在机制尚不明确。极性蛋白在维持细胞形态和功能中至关重要，其失调与肿瘤发生发展密切相关。RICH1（也称为ARHGAP17）作为一种极性相关蛋白，此前已被证实是乳腺癌的抑癌分子，但其在调控肿瘤免疫微环境中的作用仍是一片未知的“蓝海”。

为了揭开RICH1在乳腺癌免疫调控中的神秘面纱，来自西安交通大学第一附属医院的研究团队在《npj Precision Oncology》上发表了最新研究成果。他们发现，RICH1能够通过一个全新的分子机制——招募E3泛素连接酶TRIM21，促进RhoA的泛素化降解，进而抑制STAT3的磷酸化，最终上调IFN-γ的分泌，将TAMs“改造”为具有抗肿瘤活性的M1表型。这一发现不仅为理解肿瘤细胞与免疫细胞之间的“对话”提供了新视角，也为开发联合免疫治疗策略提供了潜在的生物标志物和新靶点。

关键技术方法

本研究综合利用了生物信息学分析、细胞与动物模型、分子生物学及生物化学技术。研究团队首先利用TCGA和GEO数据库进行生物信息学分析，评估RICH1表达与免疫细胞浸润及患者预后的相关性。在实验验证方面，构建了RICH1过表达（4T1-RICH1 OE）和敲除（HC11-RICH1 K/O）的细胞模型，并建立了小鼠原位移植瘤模型。通过流式细胞术、免疫组化（IHC）和多重免疫荧光（mIHC/IF）等技术，在体内外评估了TAMs的极化状态。在机制探索上，运用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析、蛋白质印迹（Western Blot）、泛素化实验、分子对接模拟及ELISA等技术，深入解析了RICH1-TRIM21-RhoA-STAT3信号轴的作用机制。

研究结果

高表达RICH1与乳腺癌中促炎性M1样巨噬细胞浸润及良好预后相关

通过对TCGA数据库中1097例乳腺癌样本的转录组数据分析，研究人员发现RICH1高表达与多种免疫相关通路富集显著相关。进一步分析显示，RICH1高表达组中M1样巨噬细胞、活化的CD4记忆T细胞和初始B细胞的浸润水平更高，而M2样巨噬细胞和静息肥大细胞的浸润水平则显著降低。生存分析证实，RICH1高表达是乳腺癌患者总生存期（OS）的有利预后因素。空间转录组分析更直观地显示，在RICH1高表达区域的边界，促炎性M1样TAMs（CXCL9⁺和CXCL11⁺）显著聚集。

RICH1促进4T1荷瘤小鼠肿瘤微环境中M1样TAMs的浸润

为了在体内验证RICH1的功能，研究人员构建了RICH1过表达的4T1乳腺癌细胞（4T1-RICH1 OE）并将其原位移植至小鼠体内。结果显示，与对照组（4T1-NC）相比，4T1-RICH1 OE组小鼠的肿瘤体积和重量均显著减小。流式细胞术和免疫荧光分析证实，4T1-RICH1 OE组肿瘤组织中CD45⁺F4/80⁺CD86⁺M1样TAMs的比例显著增加，而M2样TAMs的比例则无明显变化。更重要的是，当使用Clophosome清除小鼠体内的巨噬细胞后，RICH1过表达带来的抑瘤效应被显著削弱，这直接证明了RICH1的抑瘤作用依赖于巨噬细胞的浸润。

4T1-RICH1 OE的条件培养基在体外促进M1样极化

为了探究肿瘤细胞来源的RICH1是否直接调控巨噬细胞极化，研究人员用4T1-RICH1 OE细胞的条件培养基处理RAW264.7巨噬细胞。结果显示，与对照组相比，4T1-RICH1 OE的条件培养基能显著诱导RAW264.7细胞向F4/80⁺iNOS⁺M1表型极化，并上调M1标志物（如IL12、IL6、TNFα等）的mRNA表达水平。功能实验进一步证实，经4T1-RICH1 OE条件培养基极化的巨噬细胞，在体内与野生型4T1细胞共移植时，能显著抑制肿瘤的生长。

RICH1通过分泌IFN-γ和趋化因子促进巨噬细胞向M1样极化

机制探索发现，RICH1过表达的4T1细胞能分泌更高水平的IFN-γ和CXCL9，而促进M2极化的IL-4和IL-13的分泌水平则较低。在RICH1敲除的HC11细胞中，IFN-γ和CXCL9的分泌水平则显著降低。体内实验进一步证实，在RICH1过表达的4T1细胞中敲低IFNG（IFN-γ的编码基因），会逆转RICH1过表达带来的抑瘤效应，并显著减少M1样TAMs的浸润。这表明IFN-γ是RICH1调控巨噬细胞极化的关键下游因子。

RICH1通过与TRIM21结合并抑制RhoA-STAT3通路的活化来上调IFN-γ的表达水平

为了阐明RICH1如何上调IFN-γ，研究人员通过免疫共沉淀-质谱联用（Co-IP-MS）技术，筛选出与RICH1相互作用的蛋白，并锁定了一个与天然免疫相关的E3泛素连接酶——TRIM21。进一步的实验证实了RICH1与TRIM21之间存在直接的相互作用。在RICH1过表达的细胞中，总RhoA蛋白水平下降，STAT3的磷酸化水平（p-STAT3）受到抑制，而IFN-γ的表达则上调。相反，在RICH1敲除的细胞中，RhoA和p-STAT3水平升高，IFN-γ水平降低。

RICH1-TRIM21的结合在RhoA的泛素化降解和STAT3的非活化中起关键作用

深入机制研究发现，RICH1的存在会缩短RhoA蛋白的半衰期，而蛋白酶体抑制剂MG132或Bortezomib可以逆转RICH1诱导的RhoA降解。泛素化实验证实，RICH1能促进RhoA的泛素化修饰。更重要的是，RICH1增强了TRIM21与RhoA之间的结合，而敲低TRIM21则能显著逆转RICH1过表达导致的RhoA降解、STAT3磷酸化抑制以及IFN-γ上调。Pull-down实验还发现，RICH1不仅能促进RhoA的降解，还能直接促进RhoA-GTP的水解，从而双重抑制RhoA的活性。分子对接模拟揭示了RICH1、TRIM21和RhoA三者之间具体的结合位点。体内实验最终证实，在RICH1过表达的4T1细胞中敲低TRIM21，会显著促进肿瘤生长，并减少M1样TAMs的浸润。

M1浸润与乳腺癌患者RICH1表达的相关性——与ICIs联合应用的潜在生物标志物

在22例三阴性乳腺癌（TNBC）患者组织样本中进行的验证显示，RICH1高表达的患者肿瘤组织中，CD68⁺HLA-DR⁺M1样TAMs的浸润比例更高。此外，RICH1过表达还促进了CD8⁺T细胞的浸润和颗粒酶B（Granzyme B）的表达，并增强了肿瘤细胞的凋亡。为了探索RICH1的临床转化价值，研究人员在荷瘤小鼠模型中联合使用了抗PD-1单抗（Sintilimab）。结果显示，RICH1高表达组对PD-1抑制剂的治疗反应最为显著，肿瘤抑制效果最强，且M1样TAMs的浸润水平最高。

研究结论与讨论

本研究首次揭示了极性蛋白RICH1在乳腺癌免疫微环境重塑中的关键作用。研究团队发现，RICH1在乳腺癌细胞中高表达时，能够作为“桥梁”分子，招募E3泛素连接酶TRIM21，促进RhoA的泛素化降解，同时直接促进RhoA-GTP的水解，从而双重抑制RhoA的活性。RhoA活性的降低，进一步抑制了下游STAT3的磷酸化，最终解除了对IFN-γ表达的抑制，促使肿瘤细胞分泌更多的IFN-γ。这些IFN-γ进入肿瘤微环境，如同发出“集结号”，将巨噬细胞“招募”并“改造”为具有抗肿瘤活性的M1表型，从而抑制肿瘤的生长。

该研究不仅阐明了RICH1调控巨噬细胞极化的全新分子机制，更重要的是，它揭示了RICH1作为免疫相关生物标志物的巨大潜力。研究结果表明，RICH1高表达的乳腺癌患者可能对免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体）治疗更为敏感。这为未来实现乳腺癌的精准免疫治疗提供了新的思路：通过检测RICH1的表达水平，筛选出可能从联合免疫治疗中获益的优势人群，从而将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，为患者带来新的希望。