无痕环状mRNA CAR-T疗法：突破实体瘤治疗瓶颈，开启精准免疫新时代

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Scarless circular mRNA-based CAR-T cell therapy elicits superior antitumor efficacy

本研究针对病毒载体CAR-T疗法存在的基因组整合风险及安全性问题，创新性开发了高效无痕环状mRNA（cmRNA）合成平台Hi-Scarless-PIE。该技术通过优化permuted intron-exon（PIE）自剪接系统，实现了无需外源序列插入的高产率cmRNA制备，显著延长了嵌合抗原受体（CAR）在T细胞中的表达时长与强度。实验证实，基于cmRNA的CAR-T细胞在体外展现出更强的抗原特异性杀伤活性和细胞因子释放能力，并在B细胞淋巴瘤（NALM-6）和多发性骨髓瘤（MM.1S）小鼠模型中实现肿瘤清除与生存期延长。该研究为非病毒载体CAR-T疗法提供了更安全、可控的技术路径，对拓展细胞免疫治疗至自身免疫病等非癌适应症具有重要价值。

　　

近年来，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已成为血液肿瘤治疗的重要突破，但其临床应用仍面临病毒载体整合致突变风险、细胞因子释放综合征（CRS）等安全性挑战。尤其当CAR-T疗法向自身免疫病、心脏纤维化等非癌领域拓展时，永久性CAR表达带来的风险-获益平衡问题更为突出。信使RNA（mRNA）技术可通过瞬时表达CAR规避基因组整合风险，然而传统线性mRNA稳定性差、半衰期短，严重限制疗效持久性。

为解决这一难题，胡钦超、赵慧等团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》发表研究，首次报道了基于高效无痕环状mRNA（scarless cmRNA）的CAR-T细胞平台。该研究通过工程化改造permuted intron-exon（PIE）自剪接系统，开发出Hi-Scarless-PIE技术，成功合成不含外源序列的cmRNA，其翻译效率与持久性显著优于线性mRNA。

关键技术方法

研究通过以下核心实验体系验证cmRNA优势：1. 利用Hi-Scarless-PIE系统合成靶向CD19/GPRC5D的CAR-cmRNA，经RNase R消化、毛细管电泳验证环化率超90%；2. 采用电穿孔技术将cmRNA导入人原代T细胞，流式细胞术检测CAR表达动力学；3. 通过体外共培养实验评估CAR-T细胞对血液肿瘤细胞系（NALM-6、Raji、MM.1S等）的杀伤效率及细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）释放水平；4. 利用RNA-seq分析T细胞转录组特征；5. 构建NCG小鼠淋巴瘤/骨髓瘤模型，通过活体成像、流式细胞术评估cmRNA-CAR-T的体内抗肿瘤效果及安全性。

研究结果

1. 高效无痕cmRNA合成平台的构建

Hi-Scarless-PIE系统通过重构核酶结构域，使目的基因（GOI）两端直接模拟经典PIE中E2/E1功能，实现无需外源序列插入的环化。Sanger测序确认剪接位点序列精确，毛细管电泳显示环化率达90%，且cmRNA产物经RNase R处理后仍稳定存在。

2. cmRNA在体外与体内均实现持久蛋白表达

在HEK-293T细胞中，cmRNA编码的高斯荧光素酶（GLuc）表达半衰期达4.5天，而线性mRNA仅2.5天。将cmRNA包裹于脂质纳米粒（LNP）后肌肉注射小鼠，荧光素酶表达可持续14天，且无痕cmRNA表达量显著高于含痕量cmRNA（第3天*_p<0.05）。

3. cmRNA显著提升CAR在T细胞中的表达强度与持续时间

流式细胞术显示，线性mRNA组CAR表达在转染后6小时达峰，第4天消失；而cmRNA组表达持续至第7天，且峰值荧光强度（MFI）更高，提示细胞表面CAR密度提升。RT-qPCR证实cmRNA在胞内半衰期延长。

4. cmRNA-CAR-T细胞展现更强杀伤活性与细胞因子释放

在效应细胞-靶细胞（E:T）共培养实验中，转染后第4天，线性mRNA-CAR-T对NALM-6细胞的杀伤率降至40-60%，而cmRNA组仍维持75-100%。cmRNA-CAR-T分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2水平在所有E:T比例下均显著高于线性组（*_p<0.05）。

5. 转录组特征揭示cmCAR-T细胞持续活化状态

RNA-seq分析显示，cmCAR-T细胞中细胞毒性基因GZMB表达显著上调，而耗竭标志物（PDCD1、TIGIT等）未明显升高。差异基因富集分析提示cmCAR-T细胞在干扰素信号通路中持续激活。

6. 动物实验验证cmRNA-CAR-T疗法的优越性

在NALM-6淋巴瘤模型中，cmRNA-CAR-T细胞输注后第5天仍占外周血T细胞的50%以上（线性组第3天即消失）。多次输注3×10⁶个cmRNA-CAR-T细胞可完全清除肿瘤，且无显著体重下降或CRS相关因子（IL-6、G-CSF）升高。

结论与展望

该研究通过Hi-Scarless-PIE平台成功构建了高效、安全的cmRNA-CAR-T疗法体系。相较于线性mRNA，cmRNA不仅延长CAR表达时间，还通过提升CAR密度增强T细胞活化与杀伤能力。在多种血液肿瘤模型中，cmRNA-CAR-T展现出与慢病毒转导CAR-T相当的肿瘤清除效果，且避免了病毒载体相关的免疫毒性风险。这一非病毒、瞬时表达策略为CAR-T疗法在自身免疫病等非癌领域的应用提供了更可控的技术路径，有望成为下一代细胞免疫治疗的通用平台。