溶瘤腺病毒递送新抗原可增敏低突变肿瘤对PD-1抑制剂的反应并抑制转移

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Oncolytic adenovirus delivery of neoantigens sensitizes low-mutation tumors to anti-PD-1 therapy and prevents metastasis

本研究针对低肿瘤突变负荷(TMB)肿瘤（如肝内胆管癌ICC）对免疫疗法反应差的难题，开发了名为NeoViron的溶瘤腺病毒(OAV)平台，该平台可在肿瘤细胞内协同表达新抗原和树突状细胞生长因子Flt3L。研究证实，NeoViron通过增强新抗原表达、促进cDC1介导的抗原呈递、并诱导细胞毒性CD8+组织驻留记忆T细胞(Trm)和TCF1+CD8+干细胞样T细胞(Tstem)扩增，有效抑制肿瘤生长并预防转移。与抗PD-1联用可产生协同效应，为治疗新抗原稀缺的实体瘤提供了有前景的新策略。

　　

癌症免疫治疗领域近年来取得了显著进展，然而，一个顽固的难题依然横亘在研究者面前：对于那些肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）较低的“免疫冷”肿瘤，例如肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma, ICC）和胰腺癌，现有的免疫疗法，包括新抗原疫苗和免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体），往往效果不佳。其核心瓶颈在于这类肿瘤产生的能被免疫系统识别的新抗原（Neoantigens）数量稀少，且肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）存在抗原呈递功能受损、T细胞浸润不足和耗竭等问题。如何打破这一僵局，为大量缺乏有效治疗手段的低TMB肿瘤患者带来希望，成为了亟待解决的科学挑战。

在此背景下，由沈科宇、苏英瀚、秦伦旭等研究者领衔的团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了一项创新性研究。他们独辟蹊径，将目光投向了溶瘤病毒（Oncolytic Viruses, OVs）。溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞内复制，裂解细胞，并改变肿瘤免疫微环境。研究者设想，能否利用溶瘤病毒作为“特洛伊木马”，将稀缺的新抗原高效、特异性地递送至肿瘤内部并进行扩增，同时协同增强抗原呈递能力，从而“加热”这些“免疫冷”肿瘤？

为了验证这一设想，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先在多种小鼠肿瘤模型（包括黑色素瘤B16F10、结肠癌MC38、肝癌Hep53.4和低突变肝内胆管癌mICCN-4）中，通过全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）和液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）联用的方法鉴定出各自的新抗原。针对新抗原极其匮乏的mICCN-4模型，他们通过算法预测了候选新抗原。接着，他们构建了能够携带这些新抗原的溶瘤腺病毒（Oncolytic Adenovirus, OAV）载体AdSVP-NAg。更重要的是，他们进一步开发了名为NeoViron的多功能OAV平台，该平台能够在一个病毒内共表达新抗原和树突状细胞（Dendritic Cell, DC）生长因子Flt3L，旨在同时解决新抗原稀缺和抗原呈递不足两大难题。

研究过程中运用的关键技术方法主要包括：利用WES和LC-MS/MS联用进行新抗原鉴定；构建并生产具有肿瘤特异性复制能力的基因工程溶瘤腺病毒；建立小鼠皮下、原位移植及转移瘤模型进行体内药效评估；通过流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫斑点（ELISpot）等技术分析肿瘤免疫微环境的变化；并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）在单细胞水平深度解析免疫细胞亚群及其分化轨迹。部分临床相关性分析使用了来自患者的术后样本和公共数据库（如TCGA）的转录组数据。

研究结果

溶瘤病毒介导的新抗原递送在多肿瘤模型中引发强效肿瘤特异性免疫

研究人员成功构建了携带不同肿瘤模型新抗原的溶瘤腺病毒AdSVP-NAg。在B16F10、MC38和Hep53.4等高TMB肿瘤模型中，AdSVP-NAg显示出与合成长肽（Synthetic Long Peptide, SLP）疫苗联合空病毒载体相当的肿瘤抑制效果，并能诱导更广泛的新抗原特异性T细胞反应，促进颗粒酶B（GZMB）⁺CD8⁺T细胞在肿瘤内浸润。这证明了OAV介导的新抗原递送策略的有效性。

溶瘤病毒递送可克服免疫冷性胆管癌中的新抗原稀缺问题

在仅有19个非同义单核苷酸变异（Nonsynonymous Single Nucleotide Variants, SNVs）的低突变mICCN-4模型中，AdSVP-NAg^mICC（携带预测的10个新抗原表位）成功在感染后上调了新抗原的表达，并通过质谱检测到其中三个表位的呈递。与SLP联合空载体相比，AdSVP-NAg^mICC单药即表现出更显著的肿瘤生长抑制效果，并增强了针对特定新抗原的T细胞反应和CD8⁺T细胞的杀伤功能。这表明在低突变肿瘤中，OAV介导的新抗原放大策略具有独特优势。

在溶瘤病毒中共表达Flt3L进一步增强树突状细胞介导的抗肿瘤免疫及其抗肿瘤效果

为了增强抗原呈递，研究者构建了表达Flt3L的溶瘤病毒AdSVP-Flt3L。该病毒分泌的Flt3L能有效促进树突状细胞，特别是常规1型树突状细胞（cDC1s）的增殖和分化。体内实验表明，AdSVP-Flt3L能抑制肿瘤生长，并显著增加肿瘤内DC和cDC1的数量。基于此，他们构建了共表达新抗原和Flt3L的NeoViron。NeoViron展现了比单独使用AdSVP-NAg或AdSVP-Flt3L更强的抗肿瘤效果，并显著增加了肿瘤内CD8⁺T细胞（尤其是PD-1⁺GZMB⁺亚群）以及DC/cDC1的浸润。CD8⁺T细胞耗竭实验证实了其抗肿瘤作用依赖于CD8⁺T细胞。

协同免疫检查点阻断释放耗竭T细胞潜能以增强NeoViron疗效

研究发现NeoViron治疗也诱导了部分PD-1⁺GZMB^-的潜在耗竭T细胞增加。因此，将NeoViron与抗PD-1抗体联用。在mICCN-4原位移植模型中，联合治疗相比NeoViron单药进一步抑制了肿瘤生长，延长了小鼠生存期，并显著促进了具有细胞毒性的GZMB⁺PD-1⁺CD8⁺T细胞的浸润，同时维持了DC/cDC1的高水平浸润。多重免疫荧光显示cDC1与CD8⁺T细胞在肿瘤内存在协同相互作用。

联合治疗促进CD69⁺CD8⁺T_rm和TCF1⁺CD8⁺T_stem细胞的克隆扩增

通过单细胞RNA测序深度解析免疫微环境，发现联合治疗显著增加了CD8⁺T细胞中的多个亚群，特别是高表达细胞毒性分子（如Gzmb, Prf1）和组织驻留标记CD69的CD8_T1_Gzmb（类似于组织驻留记忆T细胞, T_rm），以及表达干细胞相关转录因子Tcf7（即TCF1）的CD8_T2_Tcf7（干细胞样T细胞, T_stem）。伪时序分析揭示了从T_stem向T_rm分化的轨迹，且联合治疗进一步增强了T_rm的细胞毒性。细胞通讯分析表明cDC1与T_rm之间存在强烈的MHC-I信号通路介导的相互作用。对肝癌和胆管癌患者样本的分析显示，肿瘤内高浸润水平的T_rm和T_stem与患者更长的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）相关。

NeoViron保护CD69⁺CD8⁺T_rm细胞以抵抗肿瘤转移

在肿瘤切除后再攻击的转移模型中，预先用NeoViron治疗可显著减少mICCN-4和Hep53.4模型的肝和肺转移灶数量。免疫荧光显示，在转移灶处有CD69⁺CD8⁺T_rm细胞的聚集，表明NeoViron诱导的免疫记忆能有效预防肿瘤转移。

结论与意义

本研究成功地开发了NeoViron这一多功能溶瘤腺病毒平台，它通过三种协同机制克服了低TMB肿瘤对免疫疗法的抵抗：在肿瘤细胞内原位扩增新抗原；通过Flt3L招募和扩增关键的抗原呈递细胞cDC1；诱导产生具有强大杀伤活性和记忆功能的CD8⁺T_rm和具有自我更新能力的T_stem细胞。该策略不仅能在新抗原相对丰富的肿瘤模型中有效，更能将“免疫冷”的胆管癌微环境转化为T细胞浸润的“热”肿瘤，显示出广泛的适用性。尤为重要的是，NeoViron与抗PD-1疗法联用展现出协同效应，并能有效预防肿瘤转移。

这项研究为治疗新抗原稀缺的实体瘤（如肝胆癌）提供了一种全新的、具有转化潜力的个性化癌症免疫治疗策略。它超越了传统疫苗单纯递送抗原的思路，创造了一个集抗原增强、呈递强化和微环境重塑于一体的综合性治疗平台，为攻克当前免疫治疗的难点开辟了新的道路。