基于等温无酶级联催化发夹组装诱导DNAzyme的miRNA-21高灵敏检测新策略

《Scientific Reports》：Isothermal and protein-free cascade catalytic hairpin assembly induced-DNAzyme sensing strategy for sensitive miRNA analysis

为解决传统miRNA检测方法对温度控制要求严苛、依赖蛋白酶且灵敏度不足的问题，研究人员开发了一种名为CHA-DNAzyme的等温无酶级联放大传感策略。该策略通过整合催化发夹组装(CHA)与脱氧核酶(DNAzyme)技术，实现了对肿瘤标志物miRNA-21的高灵敏、高特异性检测，检测限达8.70 pM，在血清样本中表现出优异的分析性能，为肿瘤精准诊断提供了新工具。

　　

在肿瘤诊断的战场上，科学家们一直在寻找能够精准预警的“哨兵”。微小核糖核酸(miRNA)就是这样一类关键分子，它们虽然个头小，却在调控基因表达、影响肿瘤发生发展中扮演着重要角色。其中，miRNA-21尤为引人注目，它在多种癌细胞中异常高表达，是极具潜力的肿瘤诊断和预后评估的生物标志物。

然而，要精准捕捉到这些“哨兵”的踪迹却并非易事。miRNA本身在生物样本中含量极低，且家族成员间序列相似度高，极易被降解。目前主流的检测方法，如实时荧光定量PCR(qPCR)和下一代测序(NGS)，虽然灵敏度高，但往往需要复杂的温度循环、昂贵的蛋白酶，且操作繁琐，限制了其在临床快速诊断中的应用。因此，开发一种操作简单、成本低廉且灵敏度高的miRNA检测新方法，成为了科研人员亟待攻克的难题。

为了打破这一瓶颈，来自中国人民解放军联勤保障部队大连康复疗养中心的研究团队另辟蹊径，将目光投向了两种功能强大的核酸工具——催化发夹组装(CHA)和脱氧核酶(DNAzyme)。他们巧妙地将二者结合，设计出一种名为CHA-DNAzyme的等温无酶级联放大传感策略，成功实现了对miRNA-21的高灵敏、高特异性分析。这项研究成果于2025年发表在《Scientific Reports》杂志上，为肿瘤的精准诊断提供了一种全新的、强有力的技术手段。

为了验证这一创新策略的可行性，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先设计并合成了三种关键的发夹探针(H1, H2, H3)以及目标分子miRNA-21。其中，H1是CHA反应的启动器，H2内部隐藏着一个完整的DNAzyme序列，而H3则是带有荧光基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)的报告探针。整个检测过程在室温下进行，无需任何蛋白酶的参与。

研究团队首先通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证了CHA-DNAzyme策略的组装可行性。实验结果表明，在目标miRNA-21存在下，H1和H2能够成功组装成双链复合物，并释放出具有催化活性的DNAzyme。随后，荧光分析进一步证实，该策略只有在miRNA-21和Mg²⁺共同存在时，才能产生强烈的荧光信号，证明了其低背景和高特异性的特点。

为了获得最佳的检测性能，研究人员对反应条件进行了系统优化。他们发现，在25°C、30 mM Mg²⁺、H1和H2浓度均为100 nM、H3浓度为600 nM的条件下，该策略能够发挥出最大的信号放大能力。在优化条件下，该策略对miRNA-21的检测限达到了8.70 pM，并且在10 pM至5 nM的浓度范围内呈现出良好的线性关系。此外，该策略对单碱基错配的miRNA序列具有极高的区分能力，显示出卓越的特异性。

为了评估该策略在真实临床样本中的应用潜力，研究人员将其应用于人血清样本中miRNA-21的检测。结果显示，在50 pM至1000 pM的加标浓度范围内，回收率在96.28%至104.98%之间，相对标准偏差(RSD)均小于6%，证明了该策略在复杂生物基质中依然能够保持准确、可靠的检测性能。

主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 探针设计与合成：设计并合成了用于CHA反应的发夹探针H1、H2以及荧光报告探针H3，并对H3进行了FAM/BHQ1荧光标记。2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：用于验证CHA-DNAzyme策略的组装可行性和DNAzyme的切割活性。3. 荧光光谱分析：用于实时监测反应动力学、评估检测灵敏度、特异性以及在血清样本中的加标回收率。4. 血清样本分析：使用商业来源的正常人血清作为基质，进行加标回收实验以评估方法的实际应用能力。

研究结果

CHA-DNAzyme传感策略的原理验证

研究人员首先通过凝胶电泳和荧光光谱分析验证了该策略的可行性。PAGE结果显示，在miRNA-21存在下，H1和H2能够成功组装成双链复合物，并释放出具有催化活性的DNAzyme，进而切割报告探针H3，产生低分子量片段。荧光分析进一步证实，只有在miRNA-21和Mg²⁺共同存在时，才能产生强烈的荧光信号，而缺少其中任何一个条件，信号均与背景水平相当，证明了该策略的低背景和高特异性。

CHA-DNAzyme策略的级联放大优势

为了证明该策略的级联放大优势，研究人员将其与单独的CHA策略进行了反应动力学比较。结果显示，CHA-DNAzyme策略在60分钟内即可达到反应平台期，而单独的CHA策略在90分钟内信号仍在持续增长。这表明，整合了DNAzyme的级联放大策略不仅反应速度更快，而且信号放大能力更强，显著提升了检测灵敏度。

关键实验条件的优化

为了获得最佳的检测性能，研究人员对反应温度、Mg²⁺浓度、探针浓度等关键条件进行了系统优化。结果表明，在25°C、30 mM Mg²⁺、H1和H2浓度均为100 nM、H3浓度为600 nM的条件下，该策略能够发挥出最大的信号放大能力。

CHA-DNAzyme策略的分析性能评估

在优化条件下，该策略对miRNA-21的检测限达到了8.70 pM，并且在10 pM至5 nM的浓度范围内呈现出良好的线性关系。此外，该策略对单碱基错配的miRNA序列具有极高的区分能力，显示出卓越的特异性。在血清样本的加标回收实验中，回收率在96.28%至104.98%之间，相对标准偏差(RSD)均小于6%，证明了该策略在复杂生物基质中依然能够保持准确、可靠的检测性能。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于CHA-DNAzyme级联放大的等温无酶miRNA检测新策略。该策略通过将CHA反应与DNAzyme催化切割高效耦合，实现了对目标miRNA-21的双重信号放大，从而获得了高达8.70 pM的检测灵敏度。更重要的是，该策略在室温下即可进行，无需复杂的温度控制设备，也无需昂贵的蛋白酶，仅需三种DNA发夹探针即可完成“一锅法”反应，极大地简化了操作流程，降低了检测成本。

该策略在血清样本中表现出的优异分析性能，为其在临床肿瘤诊断中的应用奠定了坚实的基础。通过检测血液中循环的miRNA-21水平，有望为肿瘤的早期筛查、诊断分型以及预后评估提供有力的技术支持。未来，该策略的模块化设计还有望通过更换探针序列，实现对其他疾病相关miRNA的检测，展现出广阔的应用前景。