单细胞与机器学习整合分析揭示PMAIP1：结直肠癌预后及免疫治疗反应的新型生物标志物

《Scientific Reports》：Integrated single-cell and machine learning analysis identifies PMAIP1 as a novel biomarker for predicting prognosis and immunotherapy response in colorectal cancer

本研究旨在解决结直肠癌(CRC)肝转移过程中细胞凋亡失调与肿瘤微环境(TME)重塑之间内在分子联系不清的难题。研究人员通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)与TCGA数据库的批量转录组数据，结合机器学习算法(LASSO, Random Forest, XGBoost)，筛选出凋亡相关基因PMAIP1。研究发现，PMAIP1在CRC中高表达，是独立的预后不良预测因子(HR=0.39, p=0.028)，并揭示其通过上调PD-1、PD-L1等免疫检查点分子，在招募CD8+T细胞的同时诱导其功能耗竭，形成“炎症但无效”的免疫微环境。该研究首次揭示了PMAIP1在连接细胞凋亡与免疫逃逸中的双重功能，为CRC的精准诊疗提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点。

　　

结直肠癌是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，其高死亡率主要归因于肿瘤的转移，尤其是肝转移。尽管手术、放化疗及靶向治疗取得了长足进步，但转移性结直肠癌患者的五年生存率仍低于15%。这一严峻现实背后，是肿瘤内部复杂的异质性和肿瘤微环境的动态重塑。其中，细胞凋亡的失调和免疫微环境的改变是驱动疾病进展的关键生物学事件。然而，这两个过程之间，尤其是在从原发灶到肝转移灶的演进过程中，其内在的分子联系尚未被系统阐明。因此，深入解析结直肠癌肝转移过程中的免疫微环境特征，并寻找能够连接凋亡与免疫调控的核心分子，对于开发新的预后标志物和治疗策略至关重要。

为了回答这些问题，研究人员开展了一项整合性的研究，并最终将成果发表在《Scientific Reports》上。该研究通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据与TCGA数据库的批量转录组数据，结合加权基因共表达网络分析(WGCNA)和多种机器学习算法(LASSO, Random Forest, XGBoost)，系统筛选并验证了凋亡相关基因PMAIP1在结直肠癌中的核心作用。研究发现，PMAIP1不仅是一个独立的预后不良预测因子，更是一个连接细胞凋亡与免疫逃逸的关键枢纽。它通过一种看似矛盾的方式发挥作用：一方面，PMAIP1的高表达与CD8⁺T细胞等效应免疫细胞的浸润增加相关；另一方面，它又通过上调PD-1、PD-L1等免疫检查点分子，诱导这些浸润的免疫细胞功能耗竭，最终促进肿瘤进展。这一发现为理解结直肠癌的免疫逃逸机制提供了新视角，并为开发联合免疫治疗策略提供了理论依据。

为了开展这项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，他们整合了来自GEO数据库的结直肠癌原发灶和肝转移灶的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集(GSE178318)以及TCGA数据库的批量转录组数据，构建了多组学分析框架。其次，利用Seurat软件包对单细胞数据进行质控、整合和细胞亚群注释，并通过CellChat算法解析细胞间通讯网络。在批量数据分析方面，采用了加权基因共表达网络分析(WGCNA)和差异表达分析，并结合LASSO、随机森林和XGBoost等机器学习算法进行特征基因筛选。最后，通过实时定量PCR(RT-qPCR)在19对临床结直肠癌组织样本中验证了核心基因的表达。

3.1 单细胞转录组图谱描绘结直肠癌原发灶与肝转移灶免疫微环境的异质性

研究人员首先利用单细胞RNA测序技术，系统解析了结直肠癌原发灶和肝转移灶在细胞生态系统层面的差异。通过t-SNE降维和细胞聚类，他们成功鉴定了19个不同的细胞亚群，并利用经典标记基因对这些细胞进行了精确注释，包括CD8⁺效应记忆T细胞、调节性T细胞(Tregs)、炎症单核细胞、癌症相关成纤维细胞(CAFs)和恶性上皮细胞等。比较分析发现，肝转移灶的免疫微环境发生了深刻的重塑。具体表现为，具有抗肿瘤潜能的CD8⁺效应记忆T细胞和炎症单核细胞在肝转移灶中显著富集；而恶性上皮细胞和某些免疫抑制细胞群则在原发灶中占主导地位。这表明在肝转移过程中，肿瘤微环境经历了一个关键的免疫状态转变，即从以免疫抑制为主的状态转变为以促炎和应激反应为特征的状态。

3.2 细胞通讯分析揭示免疫调控网络的重塑及核心信号通路的关键作用

为了阐明肿瘤微环境内的功能相互作用，研究人员应用CellChat算法系统量化了原发灶和肝转移灶中的细胞间通讯网络。全局网络分析显示，从原发灶到转移灶的演进伴随着细胞间相互作用数量和强度的广泛重塑。其中，炎症性肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、癌症相关成纤维细胞(CAFs)、CD8⁺效应记忆T细胞和恶性上皮细胞共同构成了细胞信息交换的关键枢纽。研究发现了多个在肿瘤微环境中占据中心调控位置的信号通路，包括CD99、MIF、GALECTIN、MHC-I和MHC-II信号通路。这些通路在多种细胞亚群中表现出强烈的激活，调控着细胞粘附、趋化募集、抗原呈递和免疫逃逸等关键生物学过程。特别是，MIF信号轴是CAFs与免疫抑制细胞(如调节性T细胞)之间通讯的关键介质，而CD99通路则在以CD8⁺T细胞为中心的相互作用网络中显著富集，提示其在调节T细胞向肿瘤组织浸润中可能发挥重要作用。

3.3 WGCNA分析揭示与肿瘤临床特征相关的凋亡相关基因模块

通过WGCNA网络构建和模块分析，研究人员鉴定了几个与凋亡相关的基因模块，并检验了它们与临床特征的相关性。在检测到的8个模块中，黑色模块(MEblack)与肿瘤分期呈显著负相关(r=-0.24, p=0.002)，提示该模块中的基因可能参与肿瘤抑制或转移抑制。此外，黄色模块(MEyellow)与总生存期呈中度负相关(r=-0.22, p=0.006)。这些关键模块中的枢纽基因被确定为后续分析的重点，以探索其调控网络和潜在的临床转化价值。

3.4 差异表达分析与功能富集分析

为了系统描绘驱动结直肠癌发生发展的转录组重编程事件，研究人员对肿瘤组织和癌旁正常组织进行了差异表达分析。通过严格的统计阈值，他们鉴定出一组表达水平发生显著变化的差异表达基因(DEGs)。火山图清晰地展示了转录失调的景观，包括显著上调和下调的基因。其中，与凋亡、增殖和免疫反应密切相关的关键调控因子(如FOXO1、ETV4和CDH3)显示出明显的表达偏差。功能富集分析显示，这些差异表达基因主要富集于免疫相关和细胞命运相关的生物学过程，如“单核细胞分化”、“T细胞分化”和“细胞粘附的调节”。KEGG通路分析进一步确定了它们参与多种疾病相关信号通路，包括“MAPK信号通路”、“Toll样受体信号通路”和“凋亡”通路，表明这些差异表达基因可能在肿瘤免疫微环境和凋亡调控中发挥重要作用。

3.5 基于机器学习的特征基因筛选

在差异表达基因的基础上，研究人员进一步进行了交集分析，以筛选与肿瘤进展密切相关的关键凋亡相关基因。该分析结合了凋亡基因集、T细胞相关基因集和差异表达基因集。维恩图显示，共鉴定出19个交集基因，这些基因可能代表了肿瘤免疫与细胞凋亡之间交叉调控的关键候选者。随后，研究人员构建了三种机器学习模型——XGBoost、随机森林(RF)和Boruta——来筛选预测能力最强的特征基因。XGBoost模型的特征重要性分析表明，HSPA1B、PRELID1、PMAIP1和TNF等基因贡献显著。Boruta算法进一步鉴定出一组稳定且重要的特征，与XGBoost结果高度重叠。随机森林模型的结果同样支持多个基因在分类任务中的稳定表现。最终，整合三种算法的结果，维恩图揭示了两个在所有模型中都得到鉴定的共享特征基因(PMAIP1和PRELID1)，提示它们在肿瘤分期或免疫微环境中具有潜在的诊断或预测价值。

3.6 关键基因PMAIP1在肿瘤中的表达、预后及免疫相关性分析

为了确定交集特征基因中生物学和临床研究价值最大的候选基因，研究人员对PMAIP1和PRELID1进行了系统的多维比较。首先，在表达水平上，两个基因在肿瘤组织中均显著上调。随后的TCGA-READ队列生存分析显示，PMAIP1高表达患者的总生存期显著缩短(HR=0.39, p=0.028)，而PRELID1未表现出显著的预后价值(p=0.168)。在外部验证数据集GSE60331中，两个基因的表达趋势得到了可重复的证实。ROC曲线进一步比较了两个基因的诊断性能，PMAIP1在两个独立队列中的AUC值均高于PRELID1，表明其对肿瘤的判别能力更优。此外，研究人员还探索了基因与免疫微环境的关系。PMAIP1与免疫细胞浸润表现出更广泛且显著的相关性，特别是与多种T细胞亚群、树突状细胞和巨噬细胞呈正相关；而PRELID1则主要与免疫抑制性免疫细胞呈负相关。综上所述，PMAIP1在表达特征、预后预测、免疫相关性和诊断能力方面均优于PRELID1，因此被选为后续深入机制研究和模型构建的核心基因。

3.7 PMAIP1基因的泛癌表达谱、功能注释及临床预后模型构建

为了进一步阐明PMAIP1的肿瘤学意义，研究人员进行了全面的生物信息学分析。在TCGA泛癌表达谱中，PMAIP1在多种癌症中表达升高，其中在结直肠癌(COAD, READ)、肝癌(LIHC)和胃癌(STAD)中观察到特别显著的差异。这些发现表明PMAIP1可能发挥广泛的促癌作用。随后，研究人员对PMAIP1的共表达基因进行了基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析。GO分析显示，这些基因参与多个与炎症反应、细胞外分泌和免疫迁移相关的生物学过程，如“分泌囊泡”、“白细胞迁移”和“趋化活性”。通路分析进一步强调，PMAIP1相关通路主要参与关键的炎症和免疫通路，包括“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“趋化因子信号通路”和“IL-17信号通路”。这些结果表明PMAIP1可能在调节肿瘤免疫微环境中发挥关键作用。为了临床应用，研究人员利用PMAIP1表达以及临床病理学变量(T分期、N分期、临床分期、性别)构建了生存预测列线图。结果表明，该模型可以准确预测患者的1年、3年和5年生存概率，突显了其临床应用潜力。

3.8 免疫浸润分析

关于免疫微环境，CIBERSORT分析显示，PMAIP1高表达组与多种免疫细胞类型的浸润密切相关。进一步的相关性分析表明，PMAIP1表达水平与免疫激活细胞(如CD8⁺T细胞、中央记忆T细胞(Tcm)、Th1细胞和Th2细胞)呈正相关，而与某些NK细胞亚群和γδ T细胞呈负相关。此外，PMAIP1表达与肿瘤免疫微环境评分(ImmuneScore和StromalScore)显著相关，进一步表明其与免疫细胞浸润密切相关。免疫检查点分析进一步揭示，PMAIP1表达与多种免疫检查点分子(包括PD-1、PD-L1和PD-L2)呈显著正相关。这些发现在独立队列中得到了验证，表明PMAIP1可能在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用。

3.9 PMAIP1相关基因突变图谱揭示其在肿瘤进展中的潜在作用

为了探索PMAIP1相关风险分组与肿瘤突变特征之间的关系，研究人员对高、低风险组(基于PMAIP1表达)进行了全基因组突变谱分析。结果显示，在突变频率最高的前30个基因中，观察到了显著的共突变或互斥关系。例如，TP53和APC等基因表现出显著的互斥性，而TTN和MUC16则表现出显著的共突变，提示它们在肿瘤发生发展中可能存在协同或替代作用。进一步的瀑布图分析结果表明，在PMAIP1高表达(高风险)组中，TP53、APC和TTN等基因的突变频率更高，错义突变和移码突变是主要的突变类型。在低风险组中，虽然也存在高频突变基因，但其突变频率和分布有所不同。此外，高风险组更集中于IV期、死亡和男性患者等临床特征，表明PMAIP1高表达可能与不良预后密切相关，并与独特的基因组突变图谱相关。

3.10 临床样本中核心基因表达的验证

为了进一步验证核心基因的表达水平，研究人员采用RT-qPCR检测了结直肠癌患者临床组织样本。PMAIP1基因在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织，这与生物信息学分析结果一致。

研究结论与讨论部分系统总结了本研究的核心发现，并深入探讨了其科学意义和临床价值。该研究通过整合单细胞和批量转录组学数据，首次揭示了结直肠癌肝转移过程中免疫微环境的深刻重塑，并鉴定出凋亡相关基因PMAIP1作为连接细胞凋亡与免疫逃逸的关键枢纽。PMAIP1不仅是一个独立的预后不良预测因子，更通过其双重功能——既招募效应免疫细胞，又通过上调免疫检查点分子诱导其功能耗竭——塑造了一个“炎症但无效”的肿瘤微环境。这一发现为理解结直肠癌的免疫逃逸机制提供了新视角，并为开发联合免疫治疗策略提供了理论依据。

该研究在方法学上具有创新性，它开发了一个结合“单细胞分析-批量验证-临床确认”的整合分析框架，通过机器学习算法的交叉验证，建立了一个从发现到验证再到确认的严谨研究流程。在机制上，该研究首次揭示了PMAIP1作为连接凋亡信号与免疫逃逸的双功能调节因子的独特作用。它挑战了PMAIP1仅作为促凋亡蛋白的传统观点，证明PMAIP1是结直肠癌中连接凋亡信号和免疫逃逸的关键分子枢纽。具体而言，PMAIP1一方面通过靶向抗凋亡蛋白Mcl-1调控线粒体凋亡的经典通路；另一方面，其高表达显著上调PD-1和PD-L1等免疫检查点分子，促进CD8⁺T细胞功能耗竭，并建立了一个以免疫细胞浸润增加但效应反应降低为特征的独特肿瘤微环境。这些发现揭示了PMAIP1以前未被认识的双重功能，并为结直肠癌中失调的凋亡与免疫逃逸之间的协同作用提供了新的机制见解。

在临床价值上，该研究确立了PMAIP1作为结直肠癌预后预测和免疫治疗反应评估的新型双重作用生物标志物。泛癌分析、临床队列验证和RT-qPCR实验一致证明PMAIP1在结直肠癌组织中显著过表达。多变量生存分析证实PMAIP1是与不良临床结局相关的独立预后风险因素(HR=0.39, p=0.028)。此外，PMAIP1表达与多种免疫检查点分子呈正相关，提示其可能作为免疫治疗反应的预测指标。该研究还发现，PMAIP1高表达组中TP53突变频率更高，这可能是导致PMAIP1表达失调并脱离正常凋亡检查点控制，转而服务于肿瘤恶性进展的原因之一。

然而，该研究也存在一些局限性。研究主要依赖于单细胞RNA测序和TCGA批量转录组数据进行生物信息学分析，这只能揭示PMAIP1基因与结直肠癌预后和免疫微环境指标之间的关联，无法直接证明“PMAIP1高表达是导致预后不良和免疫细胞耗竭的直接原因”。PMAIP1如何调控免疫检查点分子表达并影响免疫细胞功能的具体分子机制尚未通过实验验证。该研究对PMAIP1的功能验证仅涉及表达水平检测，缺乏细胞和动物水平的机制实验。此外，该研究的单细胞测序样本量有限，可能影响免疫微环境相关发现的普适性。尽管构建的列线图预后模型在现有数据中表现良好，但其临床应用的有效性仍需通过前瞻性、多中心、大样本临床试验进行验证。

未来的研究应侧重于以下几个方面：阐明PMAIP1调控肿瘤免疫微环境的机制基础，特别是其直接参与调节PD-L1表达的机制；开发靶向治疗药物，如针对PMAIP1或其相关通路的小分子抑制剂或单克隆抗体，并在临床前模型中评估其抗肿瘤疗效，特别是与现有免疫检查点抑制剂的联合应用；将PMAIP1表达作为预测生物标志物纳入临床试验设计，以指导结直肠癌患者的个体化治疗策略。