NEDD4通过泛素化降解SLC1A5抑制肺缺血再灌注损伤中的铁死亡

《Scientific Reports》：NEDD4 suppresses ferroptosis in lung ischemia-reperfusion injury by ubiquitinating and degrading SLC1A5

肺缺血再灌注损伤(LIRI)是胸外科手术和肺移植后的严重并发症，其发病机制与铁死亡密切相关。本研究聚焦E3泛素连接酶NEDD4在LIRI中的作用，通过TurboID邻近标记技术发现并证实了谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5是NEDD4的新作用底物。研究揭示了NEDD4通过K48连接的多聚泛素化修饰促进SLC1A5的蛋白酶体降解，从而抑制脂质过氧化和铁死亡，为LIRI的靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。

　　

在胸外科手术和肺移植过程中，肺部血液供应暂时中断后恢复血流，这本是挽救组织存活的必要步骤，但却可能引发一种被称为“肺缺血再灌注损伤（LIRI）”的严重并发症。这种损伤会导致肺功能严重受损，是术后死亡和移植物功能丧失的主要原因之一。尽管医学技术不断进步，但针对LIRI的有效治疗手段仍然有限，其复杂的分子机制尚未完全阐明。近年来，一种铁依赖性的新型程序性细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis），被证实是驱动LIRI的关键因素。铁死亡的特征是细胞内铁离子过度累积和无法控制的脂质过氧化，最终导致细胞膜破裂和细胞死亡。因此，深入探索肺组织内源性抗铁死亡的调控机制，对于开发新的LIRI治疗策略具有至关重要的意义。

细胞的生死由精密复杂的分子网络调控，其中泛素-蛋白酶体系统（UPS）如同细胞内的“垃圾处理厂”，负责标记和降解错误折叠或不再需要的蛋白质，是维持细胞内环境稳定的关键。E3泛素连接酶是UPS系统中的“特异性识别官”，它能决定哪些蛋白质将被贴上泛素“标签”并送往蛋白酶体进行降解。神经前体细胞表达发育性下调蛋白4（NEDD4）是HECT家族的重要E3泛素连接酶成员。此前的研究表明，NEDD4在心肌缺血和脑出血等疾病模型中扮演着保护角色，例如通过调控铁死亡相关蛋白来减轻组织损伤。然而，在肺部，特别是LIRI背景下，NEDD4是否以及如何发挥作用，仍然是一个未知的领域。为了解决这个问题，李建超等人的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。

为了揭示NEDD4在LIRI中的作用，研究人员综合运用了多种关键技术。在体水平，他们建立了小鼠左肺门夹闭的LIRI模型，并使用了NEDD4基因敲除（NEDD4^-/-）小鼠进行功能缺失研究。离体水平，他们采用小鼠肺上皮细胞（MLE-12）和人肺泡上皮细胞（A549）构建了缺氧/复氧（H/R）模型来模拟LIRI。为了精准捕捉NEDD4的相互作用蛋白，研究人员引入了先进的TurboID邻近标记技术，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。分子机制探索则依赖于蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光（IF）共定位、泛素化Co-IP、环己酰亚胺（CHX）追踪实验等一系列生物化学和细胞生物学方法。

NEDD4在LIRI模型中表达下调

研究首先证实，在经历缺血再灌注的小鼠肺组织以及经历缺氧/复氧处理的肺上皮细胞中，NEDD4的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。这提示NEDD4的表达减少可能与LIRI的病理过程相关。

NEDD4缺失加剧LIRI诱导的肺损伤、细胞凋亡和炎症

通过比较野生型（WT）和NEDD4^-/-小鼠在LIRI后的情况，研究发现NEDD4缺失的小鼠肺组织损伤更为严重，表现为更明显的炎性细胞浸润、肺泡壁增厚和组织结构破坏。同时，促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase 3的表达升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降，表明细胞凋亡加剧。此外，肺泡灌洗液和肺组织中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也显著升高，说明炎症反应更为剧烈。

NEDD4缺失加剧LIRI诱导的铁死亡

铁死亡的核心指标检测显示，与WT小鼠相比，NEDD4^-/-小鼠在LIRI后表现出更严重的氧化应激失衡：脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和铁离子（Fe²⁺）水平进一步升高，而抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD）的活性则进一步降低。更重要的是，两个关键的铁死亡抑制蛋白——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸/谷氨酸反向转运体轻链SLC7A11（也称xCT）的表达在NEDD4缺失的肺组织中几乎被完全抑制。这些结果明确表明，NEDD4的缺失会显著加剧LIRI过程中的铁死亡。

NEDD4过表达减轻H/R诱导的肺上皮细胞铁死亡

在细胞实验中，研究人员通过转染使肺上皮细胞过表达NEDD4。结果发现，NEDD4过表达能够有效抵抗H/R引起细胞活力和增殖能力下降，减少细胞内活性氧（ROS）的积累，改善氧化应激指标（降低MDA和铁，提升GSH-Px和SOD），并逆转H/R对GPX4和SLC7A11蛋白表达的抑制作用。这从功能增益的角度证实了NEDD4对肺上皮细胞具有抗铁死亡的保护作用。

NEDD4通过泛素化调节SLC1A5蛋白稳定性

机制探索是本研究最核心的部分。为了寻找NEDD4发挥作用的下游靶点，研究人员利用TurboID邻近标记技术结合质谱分析，在肺上皮细胞中筛选与NEDD4相互作用的蛋白质。经过与铁死亡相关基因数据库（ferrDb V2）比对，他们锁定了一个候选分子——溶质载体家族1成员5（SLC1A5）。SLC1A5是细胞膜上主要的谷氨酰胺转运蛋白，而谷氨酰胺代谢是驱动铁死亡的重要环节。后续的实验验证了NEDD4与SLC1A5之间存在直接的物理相互作用。更重要的是，研究发现NEDD4能够催化SLC1A5发生泛素化修饰，并且主要是通过K48连接的多聚泛素链，这是蛋白质被导向蛋白酶体降解的经典信号。功能实验表明，NEDD4的过表达会加速SLC1A5蛋白的降解，而蛋白酶体抑制剂MG132可以阻断这一过程。此外，NEDD4的催化活性对其调控SLC1A5至关重要，因为催化失活突变体（NEDD4-C867A）失去了促进SLC1A5泛素化的能力。

SLC1A5过表达逆转NEDD4介导的对H/R诱导的铁死亡的保护作用

最后，研究人员通过“挽救实验”来确认SLC1A5是NEDD4发挥作用的关键下游效应分子。在肺上皮细胞中同时过表达NEDD4和SLC1A5，发现SLC1A5的过表达完全抵消了NEDD4所带来的保护效应：细胞活力和增殖能力再次下降，ROS水平回升，氧化应激指标恶化，GPX4和SLC7A11的表达也被抑制。这强有力地证明，NEDD4正是通过靶向降解SLC1A5来发挥其抗铁死亡作用的。

综上所述，本研究系统地阐明了NEDD4-SLC1A5轴在调控LIRI中铁死亡的关键作用。在生理状态下，NEDD4通过泛素化降解SLC1A5，限制谷氨酰胺的摄取，从而抑制脂质过氧化和铁死亡。而在LIRI条件下，NEDD4表达下调，导致其对SLC1A5的抑制作用减弱，SLC1A5蛋白积累，进而促进谷氨酰胺代谢，加剧铁死亡和肺组织损伤。这项研究不仅首次揭示了NEDD4在肺脏铁死亡中的保护功能，还鉴定出SLC1A5是其新的作用底物，深化了对泛素化修饰在细胞死亡调控中作用的理解。从转化医学的角度看，靶向NEDD4-SLC1A5信号通路，例如通过药物激活NEDD4或抑制SLC1A5，可能为预防和治疗LIRI提供全新的策略和思路，具有重要的潜在临床价值。