基于全基因组SNP的韩国紫苏品种KASP分子标记开发与精准鉴别体系构建

《Scientific Reports》：Development and application of SNP markers to discriminate Korean Perilla (Perilla frutescens) varieties using genomic sequence variations

本研究针对韩国紫苏(Perilla frutescens)品种鉴别困难的问题，开发了基于全基因组重测序的SNP标记体系。研究人员通过对16个代表性品种进行重测序，获得6,183个高质量SNP，成功开发150个KASP标记，建立了种子型和叶用型紫苏的最小鉴别标记集（5个和6个标记），并构建了二进制条形码鉴别系统。该研究首次在紫苏中应用KASP技术，为品种认证、种子纯度检测和分子育种提供了重要工具，显著提升了紫苏遗传资源管理效率。

　　

在东亚传统农业中，紫苏(Perilla frutescens)作为一种兼具油料和蔬菜价值的重要作物，长期以来面临着品种鉴别困难的挑战。韩国作为紫苏的主要栽培地区，已培育出30个种子型品种和15个叶用型品种，但这些品种间形态特征相似度高，仅凭外观难以准确区分。更为棘手的是，种子型紫苏和叶用型紫苏在栽培方式和用途上存在显著差异，若在种植过程中发生品种混淆，将导致严重的经济损失。

传统的紫苏鉴别主要依赖形态学特征观察，这种方法不仅耗时耗力，而且容易受到环境因素影响，准确性有限。虽然已有研究尝试使用简单序列重复(SSR)标记进行遗传分析，但这些标记数量有限，且多集中于区分栽培种与野生类型，对于现代育种产生的高代品种鉴别能力不足。随着基因组学技术的发展，单核苷酸多态性(SNP)标记因其数量丰富、分布广泛、稳定性高等优势，已成为作物遗传研究的理想工具。 kompetitive等位基因特异性PCR(KASP)技术作为一种高效的SNP分型方法，具有成本低、通量高、准确性好等特点，已在水稻、鹰嘴豆等多种作物中成功应用，但在紫苏研究中尚属空白。

韩国农村振兴厅国立作物科学院的研究团队针对这一技术瓶颈，开展了系统的基因组学研究。通过对16个韩国紫苏品种进行全基因组重测序，研究人员获得了约325 Gb的原始数据，经过严格质控后得到225 Gb高质量序列数据，平均测序深度达到21X。使用二倍体野生紫苏'Jeju 17'(Perilla citriodora)参考基因组进行比对，平均覆盖度达到88%，成功鉴定出9,686,199个SNP位点。

研究采用多步过滤策略，首先筛选出320,433个多态性SNP，进而通过去除基因型缺失位点、排除基因组多重比对区域，最终获得6,183个高置信度SNP。基于这些SNP，团队设计了237个KASP标记，其中150个表现出稳定的多态性，分布于紫苏的10条染色体上。这些标记在48个紫苏品种中进行了验证，显示出良好的鉴别能力。

主要技术方法

研究采用全基因组重测序技术对16个紫苏品种进行测序，使用BWA软件将序列比对到二倍体野生紫苏参考基因组，通过SAMtools进行SNP calling。利用KASP技术开发分子标记，通过实时荧光PCR进行基因分型。应用主坐标分析(PCoA)和系统发育分析评估遗传关系，建立二进制条形码系统进行品种鉴别。

遗传分化分析

主坐标分析显示，种子型紫苏和叶用型紫苏在遗传结构上形成明显分离，证实了两类紫苏在基因组水平存在显著差异。然而，叶用型品种'Manchu'在分析中与种子型品种聚类更近，这一意外发现提示该品种可能具有复杂的育种历史。系统发育树分析进一步验证了这种分化模式，同时发现两个紫苏资源'YCPL177-1'和'YCPL205-1'分别与种子型和叶用型紫苏聚类，揭示了紫苏种内存在的遗传多样性。

最小标记集的建立

研究团队创新性地建立了最小KASP标记集，用于高效鉴别商业化品种。对于种子型紫苏，仅需5个标记(KASP_06、08、14、27、30)即可区分'Dayu'、'Deulsaem'等9个主要品种；对于叶用型紫苏，6个标记(KASP_21、30、47、94、233、236)足以鉴别'Namcheon'、'Soim'等8个品种。通过将基因型转换为二进制代码(与参考品种相同为"0"，不同为"1")，每个品种都获得了独特的数字身份证。

应用验证

标记的实际应用价值通过种子纯度评估实验得到验证。使用KASP_30标记分析'Dayu'和'Deulsaem'的混合样品时，不同混合比例在等位基因判别图中形成明显分离的簇群，准确反映了样品中各组分的比例。高通量测试进一步证明，这些标记可用于大规模品种鉴定，为种子质量控制和育种项目提供了可靠工具。

讨论与展望

本研究首次在紫苏中建立了完整的KASP标记系统，解决了长期存在的品种鉴别难题。尽管使用二倍体参考基因组在一定程度上限制了四倍体紫苏遗传多样性的全面解析，但随着中国'PF40'和日本'Hoko-3'等四倍体参考基因组的发布，未来研究将能更深入地探索紫苏的遗传特性。

特别值得关注的是，研究发现传统上被认为是叶用型的'Manchu'品种在遗传上更接近种子型紫苏，这凸显了分子标记在品种鉴定中的优势，能够克服单纯依赖表型特征的局限性。同时，两个紫苏资源与不同栽培类型的聚类关系，为理解紫苏的驯化历史和遗传分化提供了新视角。

该研究建立的二进制条形码系统创新性地将分子标记结果数字化，实现了品种的快速精准识别。类似系统已在大豆、小麦等作物中证明有效，在紫苏中的应用将有助于防止因品种混淆造成的经济损失，保障种子产业的健康发展。