基于OECD指南与Tox21检测的生殖发育毒性预测比较分析：分子起始事件关联研究新策略

《Scientific Reports》：Comparative analysis of OECD guideline data and Tox21 assays to improve reproductive and developmental toxicity prediction

本研究针对传统OECD测试指南（TG）评估生殖发育毒性（DART）存在周期长、成本高的问题，通过整合Tox21高通量体外检测数据与TG体内毒性数据库，系统分析了分子起始事件（MIE）与DART结局的关联。研究发现TSHR拮抗剂、FXR拮抗剂等34个MIE与发育毒性（TG 414）呈负相关，而HDAC拮抗剂等9个MIE与生殖毒性（TG 416/443）呈正相关。该研究为利用新方法策略（NAMs）补充现有监管框架提供了关键机制依据。

　　

在化学物安全评估领域，生殖与发育毒性（DART）始终是重中之重，因为其不良影响可能跨越世代，直接威胁物种生存。然而，传统的体内实验，如经济合作与发展组织（OECD）发布的测试指南（TG），包括TG 414（ prenatal developmental toxicity study，出生前发育毒性研究）、TG 416（two-generation study，两代繁殖毒性研究）等，虽然能提供可靠的危害表征，但存在周期长、成本高、需要大量实验动物等固有局限。面对数以万计待评估的化学品，传统方法显得力不从心。为此，21世纪毒理学计划（Tox21）等倡导的新方法策略（NAMs），如高通量体外筛选和定量构效关系（QSAR）模型，因其高效、伦理且能提供机制性见解而备受关注。然而，如何将这些体外检测发现的分子起始事件（MIE, Molecular Initiating Events）与复杂的体内毒性终点有效关联，从而提升DART预测能力，仍是当前研究的难点和重点。

为了解决这一挑战，由韩国德成女子大学药学院的Joohee Jung、日本明治药科大学的Yoshihiro Uesawa以及风险评估与管理咨询公司的Hyomin Lee等研究人员共同领导的研究团队，在《Scientific Reports》上发表了题为“Comparative analysis of OECD guideline data and Tox21 assays to improve reproductive and developmental toxicity prediction”的研究论文。该研究进行了一项开创性的比较分析，旨在系统性地探索体外Tox21检测数据与体内OECD TG毒性结局之间的统计关联，以识别与DART相关的关键MIE，为化学物的优先评估和机制理解提供新视角。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几个关键技术方法：首先，从OECD QSAR Toolbox (版本4.6) 数据库中系统收集了经OECD TG 414、TG 416、TG 421、TG 422和TG 443测试的化学品数据，并依据数据库中的参考结果将其明确分类为阳性或阴性。其次，利用Python脚本通过PubChem获取对应化学品的化学结构，并标准化为规范的简化分子线性输入规范（SMILES）字符串。核心分析工具是采用基于Tox21 10K化合物库构建的“毒性预测器”（Toxicity Predictor）这一QSAR平台，该平台能够预测化学品在核受体和应激反应通路等59个MIE检测中的激动剂（agonist）或拮抗剂（antagonist）活性，共生成109个预测模型。最后，研究采用Fisher精确检验来评估每个MIE的预测活性（活性/非活性）与每个OECD TG毒性结果（阳性/阴性）之间的统计学关联，并计算比值比（OR），同时利用STRING数据库对在多个TG中共同出现的MIE相关蛋白进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。

MIEs associated with OECD TG 414 data

对OECD TG 414（发育毒性）数据分析表明，在108个MIE模型中，有41个显示出显著关联。经去重处理后，共有34个MIE与TG 414阳性化学品呈负相关。这些MIE涉及应激与损伤反应（如AP-1、ARE、H2AX、HIF-1、NF-κB、p53的激动剂）、细胞凋亡（Caspase-3/7诱导剂CaspC/CaspH）和热休克反应（HSR）激活剂。在内分泌系统相关因子中，与促甲状腺激素释放激素受体（TRHR）、促甲状腺激素受体（TSHR）结合的化学品以及芳香化酶（Arom）拮抗剂呈负相关。此外，多个核受体和代谢相关因子（如CAR拮抗剂、FXR激动剂、PPARδ激动剂/拮抗剂、PPARγ激动剂/拮抗剂、RXRα激动剂、VDR激动剂/拮抗剂、RAR拮抗剂、RORγ拮抗剂、ER配体结合域（ERlbd）拮抗剂、ERβ激动剂、ERRPGC拮抗剂、内质网应激反应（ERsr）激动剂、GR激动剂）以及发育信号通路（如Shh拮抗剂和TGFβ激动剂）均与TG 414数据呈负相关。

MIEs associated with OECD TG 416 data

对OECD TG 416（生殖毒性）数据的分析则揭示了不同的关联模式。有10个模型（9个MIE）与TG 416阳性化学品呈正相关，包括ARE激动剂、ERR激动剂、PPARγ激动剂，以及CAR、ER full、FXR、HDAC、PR和Shh的拮抗剂。值得注意的是，ARE激动剂、CAR拮抗剂和PPARγ激动剂在TG 414（负相关）和TG 416（正相关）中表现出相反的统计关联模式，提示发育毒性和生殖毒性可能涉及不同的分子机制。

MIEs associated with OECD TG 421 data

对于同时涵盖生殖和发育毒性筛查的OECD TG 421，分析结果显示29个模型（27个MIE）与阳性结果呈负相关，而一个模型（PR激动剂）呈正相关（OR > 1）。与TG 414结果重叠的蛋白质较多，但AR配体结合域（ARlbd）激动剂和拮抗剂、ER alpha with stimulator（ERfulls）拮抗剂以及FXR拮抗剂仅在TG 421数据中显示出显著的负相关，突出了性激素受体相关蛋白相互作用在生殖毒性中的潜在重要性。

MIEs associated with OECD TG 422 data

OECD TG 422（联合重复剂量毒性研究伴DART筛查）数据的关联模式与TG 414和TG 421相似，未发现TG 422特有的关联蛋白。PR激动剂同样显示出OR > 1，提示与DART发生几率增加相关。

MIEs associated with OECD TG 443 data

对更现代的OECD TG 443（扩展的一代生殖毒性研究）的分析发现，芳烃受体（AhR）激动剂、HDAC拮抗剂和ERβ拮抗剂与TG 443阳性化学品呈显著正相关（OR > 1），进一步支持了HDAC抑制和AhR激活在生殖毒性中的作用。

Networks of key proteins involved in MIE associated with DART chemicals

通过维恩图和STRING蛋白互作网络分析，研究人员发现不同OECD TG之间存在共享的MIE。例如，TG 414和TG 421共享21个共同MIE，其中5个（TGFβ激动剂、ERsr激动剂、PPARδ拮抗剂、TSHR拮抗剂、FXR拮抗剂）也与TG 422共享。TG 416和TG 443共享HDAC拮抗剂这一MIE。蛋白质相互作用网络分析显示这些关键MIE相关蛋白之间存在显著的相互作用富集，并显著富集于生长负调控、细胞增殖、心脏发育、生殖结构发育、激素介导的信号通路以及核受体转录通路和细胞内受体SUMO化等生物学过程。

综上所述，这项研究通过大规模计算分析，系统地揭示了体外Tox21检测确定的分子起始事件（MIE）与体内OECD测试指南（TG）得出的生殖发育毒性（DART）结局之间存在显著统计学关联。研究结论强调，某些MIE（如TSHR、FXR、PPARδ的拮抗作用，TGFβ、ERsr的激动作用）与发育毒性（TG 414）普遍呈负相关，而另一些MIE（如HDAC拮抗作用、AhR激动作用）则与生殖毒性（TG 416/443）呈正相关。这些关联模式提示了DART潜在的不同分子机制基础。尽管二元分类法可能无法完全捕捉剂量反应关系等复杂信息，且统计关联不等于因果关系，但本研究成功地将高通量体外数据与权威体内毒性数据库相关联，为利用新方法策略（NAMs）补充甚至部分替代传统动物实验提供了有力的数据支持和机制线索。该研究构建的关联图谱有助于优先筛选具有DART潜力的化学品进行深入评估，并为进一步探索DART的分子机制和构建不良结局通路（AOP）框架奠定了重要基础，对推动毒理学评估向更高效、更机制化的方向发展具有重要意义。然而，作者也谨慎指出，将此类关联分析结果直接应用于监管决策，仍需考虑物种差异、毒代动力学、复杂通路交叉对话等复杂因素，并进行大量的后续验证。