铽和二氧化硅修饰石墨烯量子点的合成及其在叶酸受体靶向乳腺癌细胞生物成像中的应用研究

《Scientific Reports》：Synthesis of terbium and silica modified graphene quantum dots for targeted bioimaging of breast cancer cells using folate receptors

本研究针对乳腺癌早期诊断技术存在的分辨率低、靶向性差等问题，开发了一种新型荧光纳米探针Tb-GQDs-SiO2-APTES-NH2-FA。该探针通过叶酸受体靶向机制，实现了对MCF-7癌细胞的高特异性成像，量子产率达29%，细胞毒性低，在1000μg/mL浓度下细胞存活率仍超90%，为乳腺癌精准诊断提供了新策略。

　　

乳腺癌作为全球女性健康的首要威胁，其早期精准诊断始终是临床面临的重大挑战。传统影像学方法如X线 mammography（乳腺X线摄影）和CT（计算机断层扫描）虽广泛应用，但存在电离辐射风险且分辨率有限；而MRI（磁共振成像）和超声检查又受限于操作复杂性及非靶向性等缺陷。更关键的是，现有技术难以在细胞层面实现特异性识别，这促使科学家将目光投向具有分子靶向能力的纳米探针技术。

在这一背景下，叶酸受体（Folate Receptor, FR）因其在乳腺癌细胞（如MCF-7）表面过度表达的特性，成为理想的靶标。利用叶酸（Folic Acid, FA）与FR的高亲和力，可构建能够精准识别癌细胞的“智能”探针。与此同时，石墨烯量子点（Graphene Quantum Dots, GQDs）以其优异的光学性能、低毒性和良好的生物相容性，在生物成像领域展现出巨大潜力。然而，纯GQDs存在量子产率（Quantum Yield, QY）有限、功能单一等问题。通过引入稀土铽离子（Terbium, Tb³⁺）进行掺杂，不仅能增强荧光性能，还可利用Tb³⁺的长荧光寿命特性，结合时间门控成像技术有效规避生物组织自发荧光的干扰。

鉴于此，来自伊朗大不里士医学大学（Tabriz University of Medical Sciences）的Hadi Gheybalizadeh、Saeedeh Khadivi-Derakhshan等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，报道了一种新型多功能荧光纳米探针——Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂-FA。该探针巧妙地将Tb³⁺的光学特性、GQDs的纳米载体优势、二氧化硅（SiO₂）涂层的生物相容性以及FA的靶向功能融为一体，旨在实现对乳腺癌细胞的高灵敏度、高特异性荧光成像。

为制备该探针，研究人员主要采用了几个关键技术：首先，通过柠檬酸的热解反应合成GQDs，并与Tb³⁺离子进行螯合，形成Tb-GQDs；其次，利用改良的St?ber法，以APTES（氨丙基三乙氧基硅烷）为硅源，在Tb-GQDs表面包裹二氧化硅壳层并引入氨基（-NH₂），得到Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂；最后，通过EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺）/NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）偶联化学，将叶酸分子共价连接到纳米颗粒的氨基上，最终得到靶向探针。所有细胞实验均使用伊朗国家细胞库（NCBI）提供的MCF-7人乳腺癌细胞系。

3.1. 合成材料的表征

通过FESEM（场发射扫描电子显微镜）和AFM（原子力显微镜）观察，成功合成的纳米探针呈类球形，具有良好的水分散性。尽管DLS（动态光散射）显示其流体动力学直径约为112 nm，PDI（多分散指数）为0.7，表明存在团聚现象，但AFM测得的颗粒高度约为9 nm，更接近核心尺寸。FTIR（傅里叶变换红外光谱）分析证实了SiO₂壳层（Si-O-Si特征峰）和FA的成功连接。EDX（能量色散X射线光谱）则从元素组成角度验证了Tb、Si、C、O、N等元素的存在，支持了纳米结构的成功构建。Zeta电位测量显示，连接FA后纳米颗粒表面电势变为-14.4 mV，这与FA本身的负电性相符，进一步佐证了偶联成功。

3.2. UV和荧光光谱分析

紫外-可见吸收光谱显示，Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂在220 nm和290 nm处有吸收峰，分别对应于Tb³⁺的表面激发和GQDs中C=C键的π-π*跃迁。连接FA后，吸收峰发生蓝移（至265 nm），证实了表面化学环境的变化。荧光光谱表明，该纳米探针在310 nm光激发下，于425 nm处产生强烈的荧光发射，其量子产率经罗丹明B参比法计算高达29.1%，优于许多已报道的类似纳米材料。

3.3. pH、浓度和稳定性影响

研究发现，纳米探针的荧光强度在生理pH 7.4时达到最大，且发射峰位置在不同pH下保持稳定，这对其在生物体内的应用至关重要。浓度实验表明，荧光强度在一定范围内随浓度增加而增强，但在高浓度时可能因自淬灭效应而减弱。光稳定性测试显示，探针在连续紫外照射下，初始1分钟内有光漂白导致强度下降，但其后能保持稳定长达45分钟。长期稳定性优异，储存365天后荧光强度未见显著衰减。温度升高会导致荧光强度降低，这与非辐射弛豫过程增强有关。

3.6. 量子产率

使用罗丹明B作为参照物，通过公式计算得出Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂-FA的量子产率为29.1%，显示出高的荧光效率。

3.7. Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂-FA的稳定性

探针表现出良好的光稳定性和时间稳定性，适合用于长时间的生物成像实验。

3.8. 细胞靶向

3.8.1. 毒性测试

MTT法（一种检测细胞存活和生长的方法）评估了纳米探针的细胞毒性。结果表明，即使在高达1000 μg/mL的浓度下孵育24小时，MCF-7细胞的存活率仍保持在90%以上，证明该纳米探针具有优异的生物相容性，这主要归功于SiO₂涂层的保护作用和FA靶向带来的低非特异性吸附。

3.8.2. 细胞摄取研究

荧光显微镜观察直观地证实了纳米探针的靶向能力。随着探针浓度（从10 μg/mL增至1000 μg/mL）和孵育时间（0.5至24小时）的增加，MCF-7细胞周围的荧光信号显著增强，且信号主要定位于细胞膜，这与FR在细胞膜表面高表达的特征一致。摄取在2小时内即可达到较高水平。作为对照，未连接FA的Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂被细胞摄取的量极低，有力地证明了FA-FR相互作用是特异性靶向的关键机制。

综上所述，本研究成功构建了一种基于铽掺杂、二氧化硅包裹、叶酸功能化的石墨烯量子点纳米探针（Tb-GQDs-SiO₂-APTES-NH₂-FA）。该探针具备高量子产率、良好的光稳定性和pH稳定性、低细胞毒性以及最重要的——通过叶酸受体介导的对MCF-7乳腺癌细胞的高特异性靶向能力。研究结果表明，该纳米探针能够高效、特异性地标记乳腺癌细胞，荧光信号强度呈浓度和时间依赖性，为乳腺癌的早期精准诊断和未来可能的靶向治疗监测提供了强有力的新型工具。其优异的生物相容性和靶向性预示着良好的临床转化前景，为发展下一代癌症诊疗一体化纳米平台奠定了坚实的基础。