综述：计算机辅助方法在人类诺如病毒药物发现中的应用：一项全面综述

《Expert Opinion on Drug Discovery》：Computer-aided approaches for human norovirus drug discovery: a comprehensive review

　　

人诺如病毒（Human norovirus, HuNoV）是全球病毒性急性胃肠炎的首要致病原，据估算每年引发约6.85亿例感染及20万例死亡，目前尚无获批上市的抗病毒药物或疫苗。尽管历史上缺乏稳健的体外模型，但基于结构的计算方法与配体导向的计算方法——依托蛋白酶与聚合酶的晶体结构支撑——已鉴定出多类具有潜在抗病毒活性的化学型。本综述系统梳理了公共数据库中收录的所有应用计算机辅助药物发现（Computer-aided drug discovery, CADD）技术的研究，详述相关研究采用的计算策略、所识别化合物的化学结构及可获取的生物学活性数据。针对缺乏实验验证的计算机模拟结果，研究人员指出了其局限性并提出最低限度的验证实验方案。目前多数病毒蛋白三维结构的缺失限制了CADD技术发现新型化学型的能力，且计算机模拟研究后缺乏生物学验证可能延缓领域进展，导致研究者聚焦于仅在计算层面表现优异的化合物。人肠道类器官（human intestinal enteroids, HIEs）等新兴体系结合人工智能/机器学习（AI/ML）增强的CADD技术，有望加速非核苷类及共价蛋白酶抑制剂的优化与筛选。

1. 1.
   引言
   人诺如病毒属于杯状病毒科，为非包膜正链单股RNA病毒，基因组包含三个开放阅读框（ORF1-3）。ORF1编码的多聚蛋白经病毒蛋白酶切割后产生六种非结构蛋白：NS1-2（p48）、NS3（NTP酶）、NS4（p22）、NS5（VPg，共价连接于5'端）、NS6（病毒3CL蛋白酶）及NS7（RNA依赖RNA聚合酶，RdRp）。ORF2编码主要结构衣壳蛋白VP1，ORF3编码次要衣壳蛋白VP2。基于VP1序列可将诺如病毒分为10个基因群（GI-GX），进一步依据衣壳序列细分为不同基因型；基于RdRp序列则可划分为60种P型（P1-P60），其中仅部分基因型可感染人类。流行病学数据显示，GII.4曾为最流行的感染人类的基因型，但2023年7月至2024年6月期间，GII.17在德国、法国分别占暴发疫情的64%与52%，在奥地利、英国及美国的检出率较2017-2023年（剔除COVID-19大流行影响时段）分别上升39%、30%与14%。目前尚无获批的抗HuNoV治疗药物，五款VP1基疫苗处于临床试验阶段：武田公司的TAK-214在2b期临床试验中对多种基因型引起的中重度急性胃肠炎显示出61.8%的保护效力；Vaxart公司的VXA-G1.1-NN在1期临床试验中耐受性良好并可诱导系统性免疫应答，已完成1b期临床试验入组；Moderna公司的mRNA-1403在1/2期研究中安全性良好且可诱导抗原特异性免疫应答，3期临床试验已启动；中国国药集团中国生物旗下北京生物制品研究所的汉逊酵母表达VLP疫苗及安徽智飞龙科马生物制药有限公司的Longkoma疫苗均完成1期/1/2a期临床试验，但尚未公布结果。抗病毒药物研发方面，仅硝唑尼特（Nitazoxanide, NTZ）与核苷类聚合酶抑制剂CMX521进入临床试验：NTZ在小样本移植患者队列及个案报告中显示出症状缓解作用，但在后续移植患者2期临床试验中未显示临床获益；CMX521在健康志愿者1期研究中安全性良好，但目前无进一步研发进展。传统药物发现方法已鉴定出多类具有潜在抗诺如病毒活性的化合物，包括通过内部化合物库筛选、结构-活性关系（SAR）研究、老药新用及经验导向的合理设计获得的分子，其活性评价多采用小鼠诺如病毒（Murine norovirus, MNV）作为替代模型，或在携带HuNoV GI.1复制子的Huh-7细胞系（HG23细胞）中进行，仅个别研究采用人肠道类器官模型。近年来，Balb/c小鼠、斑马鱼幼虫等稳健的体内动物模型逐步建立，但多数抑制剂尚未在这些系统中完成测试。随着核磁共振与X射线晶体学解析蛋白三维结构能力的提升、计算算力的增长及大规模化合物库的普及，计算机辅助药物设计技术得到广泛应用。蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中公开的结构支持结构导向虚拟筛选（Structure-based virtual screening, SBVS），可在无三维结构的情况下采用配体导向方法基于已知活性化合物的空间与电子特征筛选类似分子，分子动力学（Molecular dynamics, MD）模拟则可动态分析结合位点相互作用以提供亲和力 insights。目前所有应用CADD技术发现抗诺如病毒潜在药物的研究均聚焦于三个靶点：主要衣壳蛋白VP1、病毒3CL蛋白酶与病毒聚合酶。本综述系统检索Google Scholar、Scopus及PubMed数据库，汇总相关研究成果并分析其潜力与局限性。
2. 2.
   诺如病毒药物发现的计算机模拟方法
   2.1. VP1
   VP1分为壳区（S）结构域与突出（P）结构域，前者形成保护病毒RNA的内层，后者暴露于表面介导与宿主细胞的相互作用。重组VP1体外表达时可自组装为具有T=3二十面体对称性的病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs），其结构与感染性病毒粒子类似。病毒感染通过P区与人组织血型抗原（Histo-blood group antigens, HBGAs）的相互作用介导，基于唾液酶免疫分析、捕获-释放电喷雾电离质谱分析及饱和转移差异核磁共振（Saturation transfer difference nuclear magnetic resonance, STD-NMR）实验已鉴定出可阻断VP1-HBGA相互作用的碳水化合物、小分子或聚合物，但这些化合物均未开展抗病毒活性评价。尽管多个HuNoV毒株P区的X射线晶体结构已被解析，但受限于宿主受体未知及缺乏共结晶抑制剂结构，针对该靶点的计算研究较少。一项研究基于HuNoV GII.1 P区与甘氨脱氧胆酸（Glycochenodeoxycholate, GCDCA）的共晶结构，采用AutoDock Vina对PubChem数据库中24种已知抗病毒活性的天然化合物开展虚拟筛选，鉴定出环 communol 为潜在抑制剂，经100 ns MD模拟及ADMET性质预测支持其成药性，但该研究未开展抗病毒实验，且筛选化合物数量有限，MD模拟应在体外活性验证后用于结合模式阐释。另一项研究结合分子对接（AutoDock 4.2）与100 ns MD模拟，阐明了2'-岩藻糖基乳糖（2'-Fucosyllactose, 2'-FL）与3'-岩藻糖基乳糖（3'-FL）与HuNoV GII.17 P区的结合模式，表明3'-FL具有更优的结合效能，为后续小分子库虚拟筛选提供了参考。另有研究基于VP1与合成A型三糖的共晶结构（PDB ID: 2OBS），采用AutoDock Vina对Maybridge库（500个化合物）及ZINC数据库筛选化合物（6423个化合物）开展片段导向对接，结合MD模拟与线性相互作用能（Linear interaction energy, LIE）法计算结合自由能，鉴定出四个可结合α-L-岩藻糖口袋的片段，但未合成连接后的分子，也未通过STD-NMR实验验证其抑制细胞进入的能力。

2.2. 3CL蛋白酶

诺如病毒3CL蛋白酶（3CLpro）属于胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族，活性中心包含高度保守的催化三联体Cys139、His30与Glu54，通过Cys139对ORF1编码多聚蛋白前体的亲核攻击实现切割，His30作为广义酸碱催化剂，Glu54协助His30去质子化催化半胱氨酸。首个蛋白酶抑制剂系列的发现与计算方法的早期应用同步：基于南安普顿诺如病毒3C蛋白酶（SN3CP）与肽类抑制剂的共晶结构，研究人员通过遗传算法构象搜索预测二肽与三肽醛、α-酮酰胺及α-酮杂环类化合物的结合模式，随后开展大规模化学优化，结合分子力学模拟与X射线晶体学解析，阐明抑制剂作用机制。这类肽类抑制剂通常在P1位引入谷氨酰胺以匹配S1口袋，P2位采用苯丙氨酸、环己基丙氨酸或亮氨酸以结合S2口袋，P3位则可修饰以调节药代动力学性质；所探索的弹头包括醛基、亚硫酸氢盐加合物、α-酮酰胺及α-酮杂环，其中α-酮杂环因脂溶性适中、细胞摄取效率高而具有优势。部分抑制剂在GI.1复制子模型或MNV模型中显示出微摩尔/亚微摩尔级活性，且在Balb/c小鼠及悉生猪模型中有效，但后续无临床推进报道。GII.4蛋白酶首个体外结构的解析推动了该基因型特异性抑制剂的开发：研究发现基于GI.1模板构建的GII.4同源模型设计的tripeptidic抑制剂在荧光共振能量转移（FRET）实验中活性与对接预测不符，凸显了实际晶体结构对CADD的重要性。基于GII.4 Sydney 2012诺如病毒蛋白酶apo状态及与抑制剂复合物的晶体结构，多项研究开展了虚拟筛选。一项研究采用三步SBVS流程，对GII.4 3CL蛋白酶（PDB: 8U1V）使用五个化合物库开展筛选，从58836个初始化合物中经高精度筛选与精细筛选最终获得17个候选物，FlipGFP实验验证其中8个具有活性，包括PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂Gedatolisib，其结合模式与100 ns MD模拟结果为后续药物化学优化提供了依据。另有研究基于距离矩阵比对（Distance matrix ALIgnment, DALI）服务器发现SARS-CoV-2 3CL蛋白酶与HuNoV蛋白酶的 structural相似性，将已开发的SARS-CoV-2蛋白酶抑制剂CIP-1及其前药CIP-PD通过共价对接与100 ns MD模拟验证其对HuNoV GI.1复制子的抑制活性（CIP-1 EC₅₀=5.67 μM，治疗指数TI=17.64；CIP-PD EC₅₀=0.46 μM，TI=217.39）及对GII.4 3CL蛋白酶的FRET抑制活性（CIP-1 IC₅₀=3.74 μM）。也有研究采用多步虚拟筛选流程，经Glide高通量虚拟筛选（HTVS）、标准精度（SP）与超高精度（XP）对接从超过1000万个商业化合物中筛选出6827个配体，经视觉检查与分子力学广义玻恩表面积（Molecular Mechanics Generalized Born Surface Area, MM/GBSA）法计算结合自由能后获得18个候选物，但均未在复制子模型中显示抗病毒活性，提示可能存在细胞穿透性问题，且未开展酶活性验证。此外，多项研究仅基于蛋白酶晶体结构开展计算筛选而未进行实验验证，例如基于PDB ID: 5T6F结构对700个化合物库开展虚拟筛选，鉴定出激酶抑制剂索拉非尼与YM201636为潜在 hit；研究rupintrivir与野生型及突变型蛋白酶结合模式的分子对接与MD模拟，并从MTiOpenScreen平台的食品成分化合物库（FOOD-lib）中筛选出amentoflavone为潜在抑制剂；基于化学相似性搜索从ChEMBL数据库中筛选97个分子，经两种对接程序评分与MD模拟后获得3个候选物，但因采用指纹图谱相似性搜索未鉴定出新型化学型；构建机器学习（ML）基3D定量构效关系（3D-QSAR）模型，从9699个化合物中筛选出3个具有不同化学骨架的候选物，经300 ns MD模拟与MM/GBSA计算显示其中一个为潜在抑制剂，但均未开展生物学验证。

2.3. RNA依赖RNA聚合酶

RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）催化负链RNA合成，并以负链为模板合成新病毒粒子的病毒RNA，其结构呈部分闭合的右手构象，包含 fingers、thumb与palm亚结构域。fingers与thumb之间的通道为模板通道，与中央通道交汇处为NTP通道，负责将核苷三磷酸（NTPs）掺入延伸链。针对该靶点的里程碑式研究基于MNV RdRp的X射线晶体结构（PDB ID: 3BSN），通过虚拟筛选Library of Pharmacologically Active Compounds（LOPAC，1280个化合物）鉴定出苏拉明（Suramin）及其类似物NF023为MNV与HuNoV RdRp抑制剂，其在荧光基体外酶抑制实验中显示纳摩尔至微摩尔级IC₅₀，且解析了MNV RdRp与两种抑制剂的共晶结构，揭示其结合于NTP进入位点（Site A）。为改善苏拉明的药代动力学性质，研究人员合成了低分子量类似物，但其仍因高分子量与多阴离子特性导致细胞膜穿透性差。后续基于HuNoV RdRp与NAF2（苏拉明/NF023的萘二磺酸部分，被认为是药效团核心）的共晶结构，发现了第二个结合口袋（Site B），位于新生RNA链离开酶的出口通道，吡哆醛-5'-磷酸-6-(2'-萘偶氮-6'-硝基-4',8'-二磺酸)四钠盐（PPNDS）在该位点显示亚微摩尔级抑制活性，其共晶结构被广泛用于后续CADD研究。研究人员所在团队长期开展聚合酶抑制剂的计算机模拟与体外实验结合研究：初期基于MNV RdRp-苏拉明与HuNoV RdRp-PPNDS的共晶结构，并行开展结构导向（PLANTS、LeadIT Flex与Glide XP）与配体导向（ROCS 3D）虚拟筛选，从SPECS库中筛选出62个候选物，经两轮酶活实验鉴定出两个完全抑制HuNoV RdRp的化合物，经SAR研究获得含呋喃-2-基亚甲基-吡唑烷-3,5-二酮骨架的hit化合物（IC₅₀=12.1 μM against MNV RdRp），组合实验显示其为PPNDS拮抗剂，靶向RdRp的不同结合位点。为解决初始化合物的溶解度问题，团队通过柔性叠合分析设计改性化学骨架，合成的一系列杂合分子中两个含((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基硫代羰基)苯甲酰胺骨架的化合物在复制子模型中显示低微摩尔级活性。后续进一步优化结构获得更高活性的类似物，并构建了靶向MNV与HuNoV RdRp抑制剂的3D-QSAR模型以指导新药设计。近期研究通过对HuNoV RdRp Site B的分子对接分析，鉴定出未占据区域，理性设计25个新化合物，其中两个显示超过50%的HuNoV RdRp抑制活性。另有研究针对HuNoV RdRp Site B与登革病毒（DENV）RdRp别构位点开展虚拟筛选，从TargetMol活性化合物库与3D-Biodiversity库中筛选出20个候选物，其中entrectinib（RAI-13）在40 μM浓度下对两种酶抑制率达~70%，在MNV感染的RAW 264.7细胞中EC₅₀=2.01 μM，在DENV2感染的A549细胞中EC₅₀=2.43 μM，生物膜干涉（Bio-layer interferometry, BLI）实验测得其与HuNoV RdRp的K_d=39 μM，为广谱抗病毒药物开发提供了起点。另一项研究从MCE活性化合物库中筛选出CX-6258盐酸盐水合物，其酶抑制IC₅₀=3.61 μM，MNV抗病毒EC₅₀=0.88 μM，CC₅₀=13.33 μM，K_d=170 μM，是一种新型非核苷类聚合酶抑制剂。还有研究基于HuNoV RdRp与CTP的共晶结构构建溶剂化分子模型，通过自由能微扰（Free energy perturbation, FEP）计算评估不同NTP类似物的结合自由能，并虚拟筛选121个NTP衍生物，其结果有待实验验证。针对MNV RdRp的多步SBVS研究从“Zinc In Man”库中筛选出rutin，其在1 μM浓度下显示MNV抑制活性，但未能抑制重组GII.4 HuNoV RdRp活性，需进一步研究。此外，多项针对聚合酶的计算机模拟研究未进行后续实验验证，例如基于HCV RdRp抑制剂数据构建机器学习模型预测HuNoV RdRp抑制剂；基于PPNDS的药效团模型从NCI抗病毒筛选库中筛选出两个含嘧啶二酮骨架的虚拟hit；基于临床候选药物CMX521构建药效团模型从PubChem数据库中筛选出两个候选物；对ZINC数据库天然化合物库及内部抗病毒化合物库开展SBVS，鉴定出多个结合能优于PPNDS的化合物，但均未开展生物学验证。

1. 3.
   验证实践指南
   目前针对已解析结构的三种病毒蛋白的计算研究大多缺乏体外生物学验证。尽管稳健体外模型的缺失阻碍了抗诺如病毒化合物向临床研究的推进，但仍需采用现有体外实验验证CADD鉴定的化合物活性，至少确认其酶抑制活性。MNV作为历史最悠久的替代模型，可通过空斑减少实验快速定量化合物抗病毒效应：将MNV与化合物共孵育后接种于RAW 264.7细胞单层，计算减少50%空斑数所需的化合物浓度（IC₅₀）；也可采用50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）实验，通过显微镜观察细胞病变效应（Cytopathic effect, CPE）计算IC₅₀；或通过MTS比色法检测细胞活力，计算恢复50%感染细胞活力的化合物浓度（EC₅₀），也可通过qRT-PCR检测病毒RNA水平或Western blotting/共聚焦荧光显微镜检测病毒蛋白表达评估化合物效应。HuNoV常用模型为携带GI.1复制子的HG23细胞系，通过qRT-PCR或Western blotting检测化合物处理后病毒基因组或蛋白水平的降低评估抗病毒活性，该模型还可通过对治疗后病毒基因组测序鉴定突变以确认靶点结合。近年人肠道类器官模型逐步成为主流，其可支持临床相关GII.4毒株复制，通过在2D单层或3D分化类器官中检测病毒基因组水平变化评估化合物活性，其中3D类器官因保留生理空间结构更具优势。此外，人Burkitt淋巴瘤B细胞系（BJAB）也被证实可支持HuNoV GII.4复制，可用于抗病毒活性验证。尽管MNV模型存在局限性，GI.1复制子缺乏完整病毒生命周期且易积累突变，类器官培养成本高昂，但仍可采用多种生化实验验证潜在hit的靶点活性：针对VP1-HBGA相互作用抑制剂，可采用唾液酶免疫分析、捕获-释放电喷雾电离质谱分析及STD-NMR实验；针对蛋白酶抑制剂，最常用FRET实验，也可采用FlipGFP实验，通过计算抑制50%蛋白酶活性所需的化合物浓度（IC₅₀）评估活性；针对RdRp抑制剂，可采用荧光RdRp活性实验或凝胶基延伸实验，通过计算抑制50%RNA合成所需的化合物浓度（IC₅₀）评估活性。
2. 4.
   结论
   多种计算机模拟方法已被用于鉴定具有抗诺如病毒潜在活性的新型化合物。VP1主要通过分子对接与MD模拟探索2'-FL与3'-FL的结合模式，为理性设计新型进入抑制剂提供参考，但由于宿主受体未知，进入抑制剂研发兴趣有限。3CLpro与RdRp的共结晶结构被广泛应用于结构导向与配体导向虚拟筛选，结合MD模拟鉴定出多个在MNV模型与GI.1复制子模型中显示活性的化合物。但大量计算研究未对虚拟hit开展任何形式的实验验证。尽管稳健细胞模型的持续缺失阻碍临床前研究，且除硝唑尼特与CMX521外无其他小分子进入临床研发阶段，计算研究仍应至少辅以生化验证。
3. 5.
   专家观点
   CADD技术已成为发现潜在治疗性化合物的核心手段，相较于传统高通量筛选、内部库筛选、合理药物设计与合成探索，可显著缩短新hit分子的发现周期并降低成本。目前诺如病毒药物研发中，2'-C-甲基胞苷等潜在活性化合物及硝唑尼特等临床试验药物的发现主要源于老药新用，这归因于两点：一是部分病毒蛋白缺乏单独或与抑制剂复合的晶体结构；二是缺乏稳健的细胞基抗病毒评价模型。目前PDB中仅收录VP1 P区、蛋白酶与聚合酶的晶体结构。VP1因P区进化压力大驱动新毒株涌现，且宿主受体不明确，靶点选择受限，更适合疫苗或抗体开发，目前所有临床阶段疫苗均为VLP基、VP1盐佐剂基、腺病毒载体编码VP1基或mRNA编码VP1基，近期研究还发现羊驼纳米抗体可通过结合保守表位抑制GII.4复制。相比之下，蛋白酶与聚合酶的结构与催化基序明确，与其他正链RNA病毒具有相似性，已有多个针对丙肝病毒、登革病毒、冠状病毒等研发的化合物被重新评估为抗诺如病毒候选药物，但未显示临床疗效。解析NS1/2、NS3、NS4与NS5等参与病毒复制的关键蛋白的三维结构并开展计算机模拟研究，对拓展当前探索的化学空间至关重要。其中NS1/2与NS5因固有无序特性难以结晶，NS3与NS4因易与脂质结构结合难以获得可溶性单体，在无实验解析结构的情况下，可采用折叠识别基的穿线法或仅依赖氨基酸序列的从头算方法构建适用于结构导向药物设计的三维模型，尽管精度较低。细胞模型的缺失与蛋白结构未解析相互关联：一方面阻碍了对病毒病理生理学的全面理解，不利于未解析蛋白功能机制研究与宿主因子靶点发现；另一方面无法可靠评价抗病毒活性，导致大量虚拟hit无法验证。MNV与GI.1复制子模型存在物种差异、代谢活性差异、筛选通量低、仅覆盖单一基因型、缺乏完整病毒生命周期等局限，BJAB细胞模型尚未成熟，人肠道类器官虽生理相关性最高，但培养成本高，仅适合小规模验证。这些技术挑战导致除疫苗企业外，鲜有企业投入小分子抗病毒药物研发，加之诺如病毒感染致死病例多集中于低收入国家，经济回报预期低，进一步降低了研发动力。大量无后续生物学验证的计算研究可能延缓新药发现进程，导致资源浪费。未来结合人肠道类器官等新兴细胞模型与AI/ML增强的CADD技术，积累多靶点、多化学类型化合物的生物学数据以构建预测模型，有望加速诺如病毒药物研发进程。

文章亮点

目前尚无获批用于治疗诺如病毒感染的疫苗或抗病毒药物，该病原体每年导致约20万例死亡。尽管通过筛选、合成化学及老药新用已鉴定出多类具有抗病毒活性的化合物，但尚未出现有前景的临床候选药物。过去十年间，计算机辅助药物设计技术已用于鉴定多个具有潜在抗诺如病毒活性的化合物，其优化有望获得临床候选药物。临床前研究长期且持续受限于缺乏支持高效病毒复制的稳健体外细胞模型。人肠道类器官等新兴细胞模型与AI/ML基计算机模拟方法的整合，有望加速新型抗病毒药物的开发。

利益声明

除文中披露内容外，作者无其他与本手稿主题或材料相关的隶属关系或财务利益冲突。

审稿人披露

本手稿的同行审稿人无相关财务或其他关系需要披露。

补充材料

本文章的补充数据可在线上获取：https://doi.org/10.1080/17460441.2025.2601118