AdiY通过组氨酸的质子化作用充当细胞质pH传感器，从而调节大肠杆菌对酸性环境的适应能力

本研究解析了大肠杆菌AdiY系统通过组氨酸His34和His60的质子化诱导构象变化，激活酸性条件下的adiA和adiC基因。实验包括突变体功能分析（His34/His60突变体丧失活性）、尺寸排阻色谱（SEC）和荧光光谱（Trp）验证构象变化，以及表面等离子体共振（SPR）分析DNA结合特性。结构预测显示AdiY在pH5.8-6.0形成四聚体稳定结合DNA，而中性pH下为单体无法激活。该机制为细菌感知胞内pH提供了分子开关模型，并为开发pH传感器应用奠定基础。

　　
### 大肠杆菌AdiY系统酸应激响应的分子机制解析

#### 一、研究背景与酸应激响应的重要性
细菌在酸性环境中的生存能力对其感染宿主（如人类肠道）至关重要。大肠杆菌（*E. coli*）通过多种酸电阻系统（AR系统）应对胃酸等极端环境。其中，arginine-dependent acid resistance（AR3/Adi）系统通过脱羧酶AdiA分解精氨酸产生碱性代谢物Agmatine，同时依赖抗港体AdiC维持质子平衡。该系统的调控核心为转录因子AdiY，但其具体传感机制长期未明。

#### 二、AdiY系统的组成与功能概述
AdiY属于AraC/XylS家族调控蛋白，其功能包含双重性：既作为转录激活因子，又具备pH传感功能。在酸性条件下（pH <5.5），AdiY通过质子化特定氨基酸触发构象变化，形成四聚体并激活靶基因（adiA和adiC）的转录。这一机制不仅维持了细胞内pH稳定，还通过代谢产物Agmatine调节细胞外pH，形成多层次的防御策略。

#### 三、AdiY的pH传感机制：组氨酸的关键作用
1. **组氨酸质子化触发构象变化**
研究发现，AdiY的N端结构域中两个组氨酸（His34和His60）对pH变化高度敏感。质子化状态下，这些组氨酸的咪唑环与相邻氨基酸（如Ala32、Pro91、Glu41、Met142）形成氢键网络，促使C端DNA结合结构域发生旋转和扩展。当pH低于6.0时，His34和His60的质子化率显著提升，导致AdiY从单体转变为四聚体，从而激活DNA结合与转录。

2. **突变体实验验证**
通过替换His34和His60为 alanine、glutamine或aspartate，发现：
- 单一突变（如H34A或H60A）导致AdiY在pH 4.4时活性丧失80%以上；
- 双突变（H34A/H60A）几乎完全阻断pH响应，即使在高pH（7.0）下仍无法激活adiA基因；
- 其他组氨酸（如H57）的突变仅部分影响功能，说明其并非核心传感位点。

#### 四、构象变化与DNA结合的分子基础
1. **可逆的pH依赖性构象转变**
通过尺寸排阻色谱（SEC）和荧光光谱分析发现：
- 在pH 7.4（生理pH）时，AdiY以单体形式存在，无法结合DNA；
- 当pH降至5.8时，AdiY单体解离为四聚体，并伴随荧光光谱红移（约2 nm），提示疏水核心暴露；
- 构象变化导致分子量增加约30%（SEC数据显示从58 kDa单体转变为232 kDa四聚体）。

2. **DNA结合的协同效应**
SPR光谱显示，野生型AdiY在pH 5.8-6.0时与adiA和adiC启动子结合，形成1:4的DNA:蛋白 stoichiometry，亲和力达1.2×10?? M。突变体（H34A/H60A）在相同pH下无法结合，证实构象变化是DNA结合的前提。此外，AdiY在pH 6.0时表现出最稳定的四聚体结构，此时其解离速率（k_d）仅为1.3×103 s?1，显著低于生理pH（7.4）下的解离速率（1.8×10? s?1）。

#### 五、与其他酸传感系统的比较
1. **CadC（膜整合传感器）与AdiY（细胞质传感器）的差异**
CadC通过质子化天冬氨酸（Asp198/200/471）感知胞外pH，其激活阈值（pH 5.8）早于AdiY响应，形成多级调控网络。AdiY直接监测细胞质pH，响应阈值（pH 5.8-6.0）更接近极端酸应激状态（pH 4.4），确保快速启动抗酸防御。

2. **与SsrA、ArsS等传感系统的对比**
SsrA（组氨酸激酶）依赖红ox信号，ArsS通过谷氨酸-组氨酸二聚体感知低pH。而AdiY通过咪唑环质子化诱导的构象变化实现精准的pH阈值调控，其分子机制更接近经典离子通道。

#### 六、进化意义与应用前景
1. **进化适应性分析**
AdiY的组氨酸位点（His34/60）在进化中高度保守，与鼠疫耶尔森菌、志贺氏菌等近缘菌存在同源结构。值得注意的是，部分细菌（如沙门氏菌）的AdiY同源物缺失His60，改由精氨酸残基替代，提示不同物种对酸胁迫的适应策略分化。

2. **生物传感器开发潜力**
研究证实AdiY的构象变化具有pH特异性（pH 5.5-6.5激活窗口），且其四聚体-DNA结合模式可扩展至其他调控蛋白的开发。例如，通过替换质子敏感组氨酸可设计宽pH范围（如pH 4-8）的通用传感器，适用于工业发酵过程监控或临床pH检测。

#### 七、实验设计的创新性
1. **多维度验证体系**
研究结合体内基因表达检测（报告基因系统）、体外蛋白互作分析（SPR）和结构生物学（AlphaFold 3预测），首次完整揭示AraC/XylS家族调控蛋白的细胞质pH传感机制。

2. **突变体策略的优化**
采用分步替换法（先单突变后组合突变）排除非特异性干扰，并通过质谱验证突变体表达水平与野生型无显著差异，确保功能丧失仅源于pH传感缺陷。

#### 八、研究局限性及未来方向
1. **当前研究的局限**
- 未明确其他氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）是否参与pH调控；
- 缺乏对AdiY四聚体形成动力学的详细解析；
- 动物模型验证不足，难以直接评估致病菌感染时的机制。

2. **未来研究方向**
- 探索His34/60在AdiY四聚体形成中的空间排列（如是否形成H-bond桥接结构）；
- 开发基于AdiY的实时pH检测芯片，集成生物发光与荧光共振能量转移（FRET）技术；
- 研究AdiY在多杀巴斯德菌等耐药菌中的功能，评估其作为抗生素靶点的潜力。

#### 九、总结
本研究首次解析了AraC/XylS家族调控蛋白通过双组氨酸质子化实现pH依赖性激活的分子机制。AdiY通过单体-四聚体互变精确调控靶基因表达，其激活阈值（pH 5.8-6.0）与细胞质酸化程度高度匹配。该发现不仅完善了细菌酸胁迫响应的理论框架，更为开发新一代pH生物传感器提供了重要工具，在环境监测、工业发酵优化及疾病诊断领域具有广阔应用前景。