整合转录组分析：利用单细胞和批量RNA测序数据揭示肝细胞癌（HCC）中与焦亡相关的预后特征

肝细胞癌中整合单细胞与bulk RNA-seq数据构建基于焦亡反应的预后模型，筛选出ADGRE2、FCER1G、SLC9A9、CYBB、SLAMF6五个核心基因，验证其独立预后价值及与免疫微环境、m6A修饰调控的关系。

　　
本研究聚焦于肝细胞癌（HCC）中焦亡作用与预后的关联性，通过整合单细胞转录组和 bulk 转录组数据，系统揭示了焦亡相关基因（PRGs）的生物学功能及其在肿瘤微环境中的调控机制，并构建了首个基于多组学整合的焦亡预后模型。研究创新性地采用单细胞测序技术解析肿瘤细胞异质性，结合 bulk 数据的统计分析，突破了传统预后模型构建的局限性。

**研究背景与科学问题**
肝细胞癌作为全球第二大常见恶性肿瘤，其5年生存率仅18%，仍面临早期诊断困难和精准治疗瓶颈。焦亡作为程序性细胞死亡途径，在肿瘤中呈现双重作用：一方面通过释放促炎因子激活免疫应答，另一方面通过调控肿瘤微环境促进免疫逃逸。尽管已有研究利用 bulk RNA-seq 构建焦亡相关预后模型，但无法解析肿瘤细胞亚群异质性对焦亡作用的影响，导致模型生物学解释力不足。

**方法学突破**
研究采用"双轨验证"策略：首先通过单细胞测序（scRNA-seq）筛选出与焦亡活性高度相关的细胞亚群（包括树突状细胞、自然杀伤细胞等），结合 bulk 数据进行加权共表达网络分析（WGCNA），成功识别出包含3796个基因的"蓝模块"（模块间相关性达0.67，p=1.1e-52）。通过LASSO回归筛选出核心生物标志物（ADGRE2、FCER1G、SLC9A9、CYBB、SLAMF6），构建了首个整合单细胞异质性和 bulk 数据的焦亡预后评分体系。

**核心发现与机制解析**
1. **预后模型构建**
基于193个焦亡相关基因的筛选，通过Cox回归和LASSO回归确定5个核心基因。模型显示高风险组（HRG）患者3年生存率降低42%（HR=2.13，95%CI 1.65-2.75），风险评分与GSDME表达呈正相关（r=0.68）。外部验证在GSE144269（n=68）和GSE116174（n=64）队列中均获得AUC>0.65的预测效能。

2. **肿瘤微环境调控机制**
HRG患者免疫抑制特征显著：
- TIDE评分升高（中位数4.32 vs 3.15，p=1.4e-5）
- CD8+T细胞浸润减少38%（p=0.003）
- HAVCR2（PD-L1）表达上调2.1倍
- IPS评分降低至0.48（p=3.2e-4）
- HLA-A/B/C/D类分子表达降低27%-43%

3. **m6A修饰的调控网络**
通过M6A2Target数据库预测发现：
- WTAP（m6A writer）在HRG中高表达（+1.8倍，p=0.002）
- HNRNPA2B1（m6A reader）表达上调2.3倍（p=0.0001）
- 形成包含15个关键m6A修饰位点的调控网络，其中NLRP3和GSDME通过m6A修饰实现级联调控

4. **关键基因功能验证**
细胞实验证实：
- HNRNPA2B1 siRNA处理使NLRP3 mRNA水平降低52%（p<0.001）
- GSDME在Hep3B细胞中 knockdown后，焦亡小体形成减少76%
- 免疫组化显示SLAMF6在肿瘤细胞膜表面表达降低63%

**临床转化价值**
1. **预后分层**：风险模型将患者分为高/低风险组，HRG组T分期更高（p=0.017），MVI评分达7.2（vs 5.1）
2. **治疗响应预测**：HRG组对CTLA-4和PD-1抑制剂敏感性降低58%（p=0.009）
3. **药物开发靶点**：通过CMap数据库筛选出5个潜在药物（如缬沙坦、雷贝拉唑），其中4个在HRG组IC50值降低2-3倍

**研究局限性**
1. 单细胞数据样本量限制（n=4-19 per dataset）
2. m6A修饰位点的生信验证尚未完成
3. 预后模型尚未通过多中心前瞻性队列验证

**学术贡献**
1. 首次揭示HNRNPA2B1通过m6A修饰调控NLRP3-GSDM通路
2. 构建首个具有细胞亚群特异性（endothelial cells:HRG富集度+41%）的焦亡预后模型
3. 发现SLAMF6与CD8+T细胞浸润存在负相关（r=-0.73）

**后续研究方向**
1. 开发基于ctDNA的液体活检检测方案
2. 构建多组学数据库（转录组+表观组+蛋白质组）
3. 评估siRNA治疗对HNRNPA2B1/m6A通路的影响

该研究为HCC提供了新的预后评估工具（风险评分系统），并揭示了m6A修饰在焦亡信号传导中的枢纽作用。未来需开展临床前实验验证靶向HNRNPA2B1的疗法（如m6A去甲基化剂），并建立动态风险评分模型以指导临床决策。