弗里德赖希共济失调中未被识别的扩展复合重复序列的高流行率及其诊断意义

《Human Molecular Genetics》：Unrecognized high prevalence of expanded composite repeats in Friedreich ataxia

本研究针对弗里德赖希共济失调（FRDA）常规基因检测中因GAA重复序列富含G/C的复合等位基因难以扩增而导致的误诊问题，通过长读长基因组测序技术系统分析了FXN基因座。结果揭示约20%患者携带致病性扩展GAA-GGA复合等位基因，并发现由Alu介导的近端FXN基因缺失新机制。研究建立了添加7-deaza-dGTP的优化检测流程，显著提升复合等位基因检出率，为FRDA精准基因诊断和遗传咨询提供重要技术支撑。

　　

在遗传性神经系统疾病研究领域，三核苷酸重复扩展障碍一直备受关注。其中，弗里德赖希共济失调（Friedreich ataxia, FRDA）作为最常见的遗传性共济失调类型，通常由FXN基因第一内含子中GAA三核苷酸重复序列的纯合扩展引起。然而，常规基因诊断依赖的长距离PCR技术存在局限性——当患者表现出单一扩展条带时，往往被简单判定为纯合子，但真相可能远非如此。

这项发表于《Human Molecular Genetics》的研究正是基于这一临床诊断困境展开。研究团队发现，标准检测方法无法有效扩增富含GC碱基的复合重复序列，导致部分致病等位基因"隐身"，进而影响患者基因分型和携带者筛查准确性。为破解这一难题，他们采用牛津纳米孔PromethION长读长测序技术，对112例经商业检测确认为FRDA的患者进行深入基因组分析。

关键技术方法包括：从费城儿童医院采集112例无关FRDA患者外周血样本；使用Nanobind CBB试剂盒提取超高分子量DNA；通过两种引物组合（GAA-104F/GAA-629R和T3F/T7R）进行长距离PCR分析；建立添加7-deaza-dGTP和甜菜碱的优化PCR体系；采用牛津纳米孔PromethION平台进行全基因组测序和PCR产物深度测序；设计特异性引物（Alu-Del-F/R）检测近端FXN缺失。

单条带患者中隐藏的遗传异质性

在初筛的112例患者中，26%（29例）呈现单一扩展条带模式。长读长测序揭示其中3例（12%）实际携带近端FXN基因缺失。

这些缺失均涉及AluY和AluSx元件的3'臂，形成新的AluY元件，删除范围覆盖FXN基因启动子、外显子1和GAA重复序列。家系分析显示FA97和FA200的缺失为遗传性，而FA68的缺失为新发突变。

扩展复合等位基因的发现

其余22例患者中，11例携带具有显著非GAA序列的扩展等位基因。其中GGA三连体串联序列最为突出，定义为GAA-GGA复合等位基因。

这些复合等位基因的GGA含量达22-342个三连体（中位数44个），多位于扩展重复序列的5'端，但仍保持嘌呤·嘧啶序列特征。64%的等位基因仍为纯GAA重复，说明复合等位基因携带者多为复合杂合子。

优化检测方法的建立

研究人员发现传统PCR难以有效扩增复合等位基因，而添加7-deaza-dGTP后可显著改善扩增效率。

当复合等位基因与纯GAA等位基因长度差异较大时，单一条带可转变为双条带模式。但对长度相近的等位基因，需通过长读长深度测序确认，添加7-deaza-dGTP使复合等位基因检出率提升至约40%。

携带者筛查的误判风险

家系分析显示，标准检测会漏检复合等位基因携带者。

三名先证者的父亲经标准检测均未显示携带扩展等位基因，而优化方法证实其为复合等位基因杂合携带者，凸显现有携带者筛查体系的漏洞。

双条带患者中的序列变异

对59例双条带患者（118个等位基因）的分析发现，86%为纯GAA重复，但仍有7个复合等位基因和多种5'/3'端中断序列。

值得注意的是，可被常规PCR扩增的复合等位基因其最长GGA串联序列显著短于"隐身"等位基因，且FA16患者等位基因中含有非典型(GACGACGAA)重复单元。

这项研究彻底更新了对FRDA致病等位基因谱的认知。长读长测序技术揭示约20%患者携带扩展复合等位基因，其中GGA三连体串联是最常见的非GAA motif。这些等位基因因GC含量高而难以被常规PCR检测，导致患者误判为纯合子，且影响携带者筛查准确性。研究建立的7-deaza-dGTP优化检测方案为临床基因诊断提供实用解决方案。

与SCA27B中FGF14基因GAA扩展不同，FXN基因的复合等位基因即使含有大量非GAA序列仍保持致病性，这可能与扩展片段长度、纯GAA序列比例以及重复方向（GAA·TTC_n更具转录抑制性）等因素相关。此外，近端FXN基因缺失的发现为表型特别严重的"纯合子"患者提供新的解释机制。

该研究强调商业基因检测实验室需更新检测策略，或采用优化PCR条件，或通过短读长测序结合ExpansionHunter等算法提升复合等位基因检出能力。虽然长读长全基因组测序目前成本较高，但针对性地测序7-deaza-dGTP扩增产物是实现精准基因分型的可行方案。这些发现不仅深化了对FRDA分子发病机制的理解，更为改善患者临床管理和遗传咨询提供重要依据。