tRNA修饰缺失通过亚优密码子对诱发核糖体碰撞及细胞质量控制的层级响应机制研究

《Nucleic Acids Research》：Suboptimal codon pairs trigger ribosome collisions and cellular quality control responses in tRNA modification mutants

本研究针对tRNA wobble尿苷(U34)修饰缺失如何通过密码子特异性翻译速率调控蛋白质稳态的机制难题，通过高精度核糖体图谱和双核糖体测序技术，首次揭示U34修饰在核糖体A位点和P位点具有差异化功能，发现亚优密码子对（如CGA-CAA）可诱发核糖体碰撞并激活Hel2依赖的核糖体关联质量控制(RQC)通路。该研究建立了密码子对优化性与细胞质量控制层级网络的新型关联模型，为神经退行性疾病等翻译相关病理机制提供新视角。

　　

在细胞蛋白质合成过程中，翻译速率的高度动态调节是维持蛋白质稳态（proteostasis）的核心环节。近年研究发现，密码子最优性（codon optimality）通过调控翻译延伸速率，直接影响蛋白质的共翻译折叠效率。然而，传统研究将同一密码子在转录组中的所有实例等同对待，忽略了序列上下文对个体密码子最优性的精细调控。特别是tRNA wobble尿苷（U₃₄）修饰（包括mcm⁵s²U、mcm⁵U和ncm⁵U）在解码过程中的作用机制尚不清晰，其缺失与多种人类疾病（如癌症、家族性自主神经失调）密切相关。

为解析U₃₄修饰在翻译调控中的精确功能，Sebastian A. Leidel团队在《Nucleic Acids Research》发表研究，通过多种前沿技术手段揭示了 tRNA修饰通过密码子对调控翻译动力学的新机制。

关键技术方法包括：①高分辨率核糖体图谱（ribosome profiling）与双核糖体测序（disome sequencing）分析翻译延伸动力学；②冷冻电镜（cryo-EM）解析核糖体翻译状态；③蛋白质聚集物纯化与质谱分析；④报告基因系统验证密码子对功能；⑤活细胞成像监测Hsf1核转位；⑥高通量显微镜技术定量Hsp104聚集点。

研究结果如下：

U₃₄tRNA修饰差异化影响认知和摆动解码

通过优化核糖体图谱技术的A位点定位精度，研究发现ncm⁵U和mcm⁵U修饰对摆动配对的G结尾密码子（AGG、CCG、GCG等）解码至关重要，而mcm⁵s²U主要影响认知密码子（AAA、CAA）。冷冻电镜结构分析表明修饰缺失并未导致核糖体特定状态滞留，说明表型变化源于特定解码事件缺陷。

tRNA修饰对密码子对解码至关重要

通过计算转录组中每个密码子的脆弱性评分，发现仅部分U_{34依赖密码子（11%-14%）在修饰缺失时显著减速。二维密码子对分析显示，P位点为CGA或ncm⁵U依赖密码子（如GCA）时，会协同加剧A位点mcm⁵s²U依赖密码子的解码减速。}

tRNA修饰缺陷诱导核糖体碰撞

报告基因实验证实CGA-CAA和GCA-CAA等亚优密码子对可引起约20%的翻译阻滞。双核糖体测序在内在转录本中观察到碰撞核糖体特征峰（停滞核糖体上游约10个密码子），质谱分析检测到Hel2依赖的uS10泛素化，证实RQC通路激活。

RQC和ISR通路协同修复密码子特异性翻译缺陷

ncs2△elp6△hel2△三突变体中，核糖体排队现象减少但分子伴侣表达显著上调。研究发现188个RQC靶标转录本富含U₃₄依赖密码子对，其mRNA水平通过No-Go衰变（NGD）降解，而RQC抗性转录本（RRTs）则富集代谢相关基因。

RQC通路与分子伴侣协同维持蛋白质稳态

聚集蛋白质组学显示非聚集蛋白更易成为RQC靶标。hel2缺失意外降低蛋白质聚集水平，机制研究表明Hsf1核转位触发热休克反应，上调Hsp104等分子伴侣表达，形成与RQC拮抗的二级防御网络。

本研究通过建立密码子对最优性的新范式，揭示了U_{34修饰在A/P位点的功能异质性，阐明了亚优密码子对诱发核糖体碰撞的分子机制。研究发现RQC与分子伴侣通路形成层级调控网络，为理解翻译动力学扰动下的蛋白质稳态维持提供新框架。该机制可能广泛存在于其他翻译调控因子（如tRNA拷贝数变异、表观转录组修饰）的作用过程中，对神经退行性疾病机制研究和RNA药物设计具有重要启示。}