醛类的结构多样性决定了其对类固醇5α-还原酶1的抑制机制是共价抑制还是非共价抑制：物种特异性差异及初步的结构-活性关系

《Chemico-Biological Interactions》：Structural diversity of aldehydes determines covalent versus non-covalent inhibition mechanisms against steroid 5α-reductase type 1: Species-specific differences and preliminary structure-activity relationships

醛类化合物对SRD5A1的抑制机制及结构活性关系研究。通过酶动力学、SPR结合、细胞实验和3D-QSAR分析，发现邻苯二甲醛（OPA）、苯甲醛（BEA）和肉桂醛（CNA）显著抑制人类SRD5A1，其中OPA显示共价结合和非竞争抑制，BEA为非共价结合，CNA虽抑制较弱但细胞活性强。结构多样性影响抑制活性和机制，氢键受体和疏水特征是关键

　　

陈俊英|齐书芳|林子健|方浩楠|张普田|李婉瑜|葛仁山|王毅艳

温州市医科大学第二附属医院及育英儿童医院麻醉与围手术医学科，中国浙江省温州市325027

摘要

类固醇5α-还原酶1型（SRD5A1）在神经类固醇生物合成中起着关键作用，环境化学物质对其的抑制可能会扰乱大脑功能。本研究通过微粒体酶测定、表面等离子体共振（SPR）结合实验、细胞实验和计算分析，系统评估了13种结构不同的醛类物质对人类和大鼠SRD5A1活性的抑制作用。三种醛类物质显著抑制了人类SRD5A1的活性：邻苯二甲醛（OPA，IC₅₀ = 2.74 μM）、苯甲醛（BEA，IC₅₀ = 45.97 μM）和肉桂醛（CNA，IC₅₀ = 67.85 μM）。SPR分析揭示了显著的机制差异：OPA表现出共价结合且解离不完全（K_D = 2.16 μM），而BEA则表现出非共价结合的特征（K_D = 35.1 μM）。所有活性化合物均表现出混合/非竞争性抑制机制。观察到了物种特异性差异，只有OPA对大鼠SRD5A1具有跨物种活性。细胞实验显示不同的效力模式，尽管酶抑制作用较弱，但CNA表现出最强的细胞效应。分子对接分析表明，OPA通过迈克尔加成与Cys124形成共价键（-6.52 kcal/mol），而BEA和CNA依赖于非共价相互作用。DTT挽救实验证实了OPA的共价抑制作用以及BEA的非共价抑制机制。OPA还独特地影响了NADPH的结合动力学，表明其结合位点同时覆盖底物区域和辅因子区域。非共价抑制剂的3D-QSAR建模表明，氢键受体和疏水特性对抑制作用至关重要。这些发现表明，醛类物质的结构多样性——特别是双醛基团与单醛基团的存在——决定了其结合机制和抑制效力，对环境健康风险评估具有重要意义。

引言

醛类是一类结构多样的有机化合物，其特征是含有一个羰基，且该羰基上至少连接着一个氢原子（图1A）。这些化合物具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗炎、免疫调节和酶抑制作用[1]、[2]、[3]。醛类在工业过程、食品保存、消毒程序和代谢过程中普遍存在于环境中[4]。甲醛和乙醛等常见醛类被认为是重要的室内空气污染物，对健康有显著影响[5]。反应性的羰基可以与酶活性位点中的氨基酸残基形成共价相互作用，从而导致酶抑制[6]。最近的研究强调了醛类作为环境内分泌干扰物的作用，它们能够干扰类固醇激素的代谢[7]。

类固醇5α-还原酶1型（SRD5A1）在神经类固醇生物合成中起着关键作用，它催化NADPH依赖性的睾酮（T）还原为二氢睾酮（DHT）以及孕酮还原为二氢孕酮，这两种物质是包括别孕酮醇在内的神经活性类固醇的前体[8]、[9]。人类基因组编码两种具有不同特性的类固醇5α-还原酶异构体[10]。SRD5A2主要在前列腺和男性生殖器官中表达，其最适pH值为5.0-5.5，是治疗良性前列腺增生的非那雄胺的主要靶点[11]。相比之下，SRD5A1在脑和皮肤中广泛表达，最适pH值为6.5-8.5，并具有更广泛的底物特异性[12]。SRD5A1是神经组织中主要的异构体，负责局部神经类固醇的生成，调节认知功能、情绪调节和神经保护[13]、[14]。通过SRD5A1介导的途径产生的神经类固醇对大脑功能和神经可塑性至关重要[13]、[14]，因此成为本环境毒性研究的重点。

最近的研究表明，各种环境化学物质可以通过不同的机制抑制SRD5A1的活性[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。这些发现表明SRD5A1是环境化学物质的敏感靶点，可能影响神经类固醇的稳态。鉴于许多醛类在环境中的广泛存在和生物累积潜力，了解它们对SRD5A1的影响对于环境健康风险评估至关重要。因此，本研究旨在通过酶动力学、表面等离子体共振、分子建模和构效关系研究，系统评估13种结构不同的醛类物质对人类和大鼠SRD5A1活性的抑制作用。

化学物质和动物

睾酮（T）和二氢睾酮（DHT）购自Steraloids（美国罗德岛州纽波特）。NADPH购自Roche（德国曼海姆）。二甲基亚砜（DMSO）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH = 7.2）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。13种代表不同结构类别的醛类物质来自商业供应商（表S1）：甲醛、乙醛、丙烯醛、丁醛、异丁醛、苯甲醛（BEA）、肉桂醛（CNA）

醛类对人类和大鼠SRD5A1活性的影响

以睾酮（T）为底物时，人类SRD5A1酶表现出典型的米氏动力学特征，K_{m值为3.45 ± 1.58 μM，与先前报道的人类SRD5A1值一致[16]、[27]。Vmax值为102.7 ± 15.13 pmol/mg/min，Vmax/Km值为29.77 pg/mg/min/μM，显示出有效的催化能力。初步筛选发现，100 μM浓度的每种醛类物质均显著抑制了人类SRD5A1的活性（图2B）。苯甲醛（BEA）和邻苯二甲醛（OPA）表现出明显的抑制作用}

讨论

本研究首次系统评估了醛类对SRD5A1的影响，发现结构多样性决定了抑制效力和基本的结合机制。关键发现是，醛类的结构——特别是醛基团的数量——决定了化合物是作为共价抑制剂还是非共价抑制剂起作用。

我们对13种醛类的SAR分析显示，简单的单醛类物质表现出弱抑制或无抑制作用，除了苯甲醛（IC₅₀ = 41.22 μM），而邻苯二甲醛（OPA）

CRediT作者贡献声明

李婉瑜：研究工作。林子健：数据分析、数据管理。齐书芳：方法学研究、数据分析。张普田：验证工作。方浩楠：验证工作、研究工作。陈俊英：撰写初稿、项目管理、方法学研究。王毅艳：撰写、审稿与编辑、监督工作、项目管理、概念构思。葛仁山：监督工作、资金获取、数据管理

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

?作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82371610，资助人R.S.G.）和浙江省自然科学基金（项目编号LY22H040010，资助人R.S.G.）的支持。我们感谢温州市医科大学科研中心的咨询和仪器支持，这对本研究起到了重要作用。