《Toxics》：RNA-Seq Can Be Used to Quantify Gene Expression Levels for Use in the GARDskin Assay
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本研究验证了RNA-Seq（RNA测序）技术作为GARDskin（基因组过敏原快速检测）皮肤致敏性评估中基因表达量化的替代方法。通过比对NanoString nCounter平台数据，证实RNA-Seq数据高度相似（Spearman相关系数0.95），并能通过现有分析流程（SVM）实现100%准确分类，为该方法在监管环境下的应用提供了有力证据。
研究背景与目的
过敏性接触性皮炎（Allergic Contact Dermatitis, ACD）是一种由小分子化学物质引发的免疫反应，其发生机制相对明确，这促进了多种皮肤致敏物识别和表征方法的发展。随着非动物方法（Non-animal Methods, NAMs）的不断演进，GARDskin（Genomic Allergen Rapid Detection）检测方法作为一种科学和监管认可的方法，被用于评估皮肤致敏物。该方法基于人源树突状细胞样细胞系，通过测量基因表达变化来预测致敏性。
目前，GARDskin检测依赖于NanoString nCounter平台进行靶向基因表达测量。尽管该平台具有操作简单、通量高、数据易于处理等优点，但探索其他兼容的基因表达量化平台，如下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术中的RNA-Seq（RNA测序），具有重要价值。RNA-Seq技术用户基础广泛，且能提供全转录组数据，为二次分析提供了更多可能性。
本研究的主要目的是评估RNA-Seq技术是否可以作为GARDskin检测中基因表达数据的量化方法，并验证其能否在现有的GARDskin分析流程中产生准确的致敏性分类。
材料与方法
研究设计与样本
研究设计分为两个主要部分。第一部分旨在比较两个平台之间的基因表达数据，共收集了24对配对RNA样本，分别对应12个GARDskin未刺激对照和12个GARDskin阳性对照（对苯二胺，PPD）。这些样本用于直接比较平台间的差异，并优化RNA-Seq平台上NanoString探针信号的重建。
第二部分旨在评估RNA-Seq数据的预测能力，包含了另外75个仅通过RNA-Seq平台获取的RNA样本，对应22种不同的化学物质处理以及GARDskin阳性和未刺激对照。为了加强研究的完整性，RNA-Seq分析由独立的合同研究组织（Contract Research Organization, CRO）进行，样本身份被编码，测序实验在不知晓样本身份的情况下完成。
RNA-Seq数据处理与信号重建
测序数据经过质量控制、接头序列和低质量碱基修剪后，使用salmon软件进行转录本定量。为了将RNA-Seq数据与现有的GARDskin模型兼容，研究团队通过序列比对将NanoString探针的靶序列映射到参考转录组上，以识别用于信号重建的候选转录本。
随后，利用24对配对样本，采用反向消除程序（backward elimination procedure）对候选转录本集进行优化，以最大化RNA-Seq数据与NanoString nCounter数据之间的相似性。最终，使用872个转录本重建了196个NanoString探针信号。
数据分析与分类
平台间的表达水平比较基于配对样本，计算了Spearman相关系数和Lin's一致性相关系数（Lin's concordance correlation coefficient）。GARDskin预测通过将重建的信号输入标准的GARDskin分析流程获得，该流程包括基于总计数（counts per total counts, CPTC）的标准化、BARA标准化（用于减少批次效应）以及使用已训练的支持向量机（Support Vector Machine, SVM）进行分类。
此外，研究还评估了测序深度对GARDskin分类的影响，通过二项式重采样（binomial subsampling）和从fastq文件进行重采样两种方法，分析了不同测序深度下的分类性能。
结果
平台间基因表达谱的比较
通过比较24对配对样本，研究发现两个平台产生的基因表达谱高度相似。对于阳性对照（PPD）处理诱导的相对效应估计，Spearman相关系数高达0.95，Lin's一致性相关系数为0.87，表明两个平台在检测基因表达变化方面具有高度一致性。
然而，也观察到少数基因在两个平台间存在显著差异。在表达水平比较中，差异较大的基因包括SNORA45、五个组蛋白簇基因（HIST1H1C, HIST1H1E, HIST1H3G, HIST1H3J, HIST2H2AA3）和UFC1。在效应估计比较中，差异较大的基因包括五个组蛋白簇基因（HIST1H1C, HIST1H1E, HIST1H3J, HIST2H2AA3, HIST2H2BF）和ACER2。这些差异可能与RNA-Seq文库构建方法（如poly-A富集）对某些特定RNA类型的捕获效率有关。
基于RNA-Seq数据的致敏性分类
将75个样本的重建信号输入标准的GARDskin分析流程后，所有化学物质均被正确分类。准确度、灵敏度和特异性均达到100%。预测的决策值（decision values）与标准检测中观察到的结果非常相似，且重复样本间的标准偏差为0.64，符合预期。
测序深度评估
通过重采样分析发现，GARDskin分类的准确性在测序深度较低时（≤100万条reads）开始明显下降。研究得出结论，平均每个样本500万至1000万条reads足以维持稳定的分类性能。在500万和1000万reads的测序深度下，重采样数据的均方根误差（Root Mean Squared Error, RMSE）和交叉熵（cross-entropy）均表明分类性能与完整数据集非常接近。
讨论与结论
本研究探索了使用RNA-Seq技术作为GARDskin皮肤致敏性评估中基因表达量化替代方法的可能性。结果表明，RNA-Seq平台与NanoString nCounter平台产生的数据高度相似，尤其是在检测基因表达变化方面。尽管少数基因存在差异，但这些差异并未影响最终的致敏性分类。
将RNA-Seq数据输入现有的、经过验证的GARDskin分析流程，能够产生与标准检测完全一致的准确分类结果。此外，研究还确定了维持稳定分类性能所需的测序深度。
综上所述，RNA-Seq可以作为GARDskin检测中基因表达量化的有效方法，用于获得可靠的致敏性分类。在遵循相关批准程序的前提下，这两种获取平台在监管背景下可被视为可互换的。未来的研究重点可放在RNA-Seq平台协议的标准化和质量标准的定义上，以促进其在GARDskin检测中的更广泛应用。
