靶向MED23通过抑制代偿性增殖与促进ROS介导的细胞死亡抑制肝细胞癌发展

《Cell Death & Disease》：Targeting MED23 inhibits hepatocellular carcinoma development by suppressing compensatory proliferation and facilitating ROS-mediated cell death

本研究针对肝细胞癌（HCC）发展中代偿性增殖机制不清的问题，揭示了中介体复合物亚基MED23在HCC中的关键作用。研究人员发现，肝特异性敲除Med23可有效抑制DEN诱导的小鼠HCC发生。机制上，MED23缺失通过降低NQO1蛋白稳定性导致ROS积累，并与转录因子RFX5协同调控IGF2表达，从而影响肝细胞存活。该研究提出了MED23-IGF2-NQO1轴作为HCC治疗新靶点。

　　

肝细胞癌是全球范围内最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的第二大原因。其主要的危险因素包括黄曲霉毒素、乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染，以及与慢性肝损伤相关的肝硬化。此外，随着生活方式的改变，与肥胖和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的代谢综合征正成为主要因素。尽管在HCC治疗方面取得了巨大进展，例如多激酶抑制剂索拉非尼和仑伐替尼，但晚期HCC患者的5年生存率仍然很低。因此，迫切需要识别新的药物靶点，阐明肝癌发生的潜在分子机制，并为HCC患者提供新的治疗策略。

为了更好地理解HCC的发病机制，研究人员使用了多种小鼠模型。其中最广泛使用的是二乙基亚硝胺（DEN）诱导的HCC模型，该模型重现了以慢性肝损伤和炎症为特征、随后形成肿瘤的人类疾病。作为一种DNA加合物形成剂，在出生后第14天单次注射致癌物DEN会诱导肝实质细胞内活性氧（ROS）积累和DNA损伤，随后导致细胞死亡。然后，库普弗细胞（驻留的肝巨噬细胞）被受损肝细胞分泌的因子激活。活化的库普弗细胞可以分泌丰富的促炎和促增殖细胞因子，从而驱动存活肝细胞的代偿性增殖，触发起始肝癌细胞的形成，并在多轮细胞死亡-炎症-再生过程中进一步促进肿瘤灶的形成。因此，ROS诱导的细胞死亡和随后的代偿性增殖对于肝脏肿瘤的起始至关重要。

中介体复合物是一个进化上保守的多亚基蛋白质复合物，以其连接转录因子（TFs）和RNA聚合酶II（Pol II） machinery以实现精确转录输出而闻名。越来越多的证据表明，中介体亚基如MED1、MED12和CDK8在癌症进展和代谢中发挥作用。先前的研究表明，中介体亚基MED23在多种细胞命运决定和癌症发展中起关键作用。通过构建肝脏特异性Med23敲除模型，研究人员揭示了肝脏MED23调节葡萄糖和脂质代谢以及四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化。这些发现促使我们研究MED23在HCC发展中的功能。

本研究通过分析HCC小鼠模型、HCC细胞系和人类临床样本，揭示了MED23在HCC中的关键作用，并确定了MED23-IGF2-NQO1轴通过抑制肝细胞死亡同时增强代偿性增殖的机制促进HCC发展。研究发现，中介体MED23是肝癌发生的关键参与者，可能作为潜在的治疗靶点。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法。他们使用了条件性基因敲除小鼠模型（Med23^f/f与Alb-Cre或Mx-Cre小鼠杂交）来研究MED23在体内HCC发生发展不同阶段的作用。通过DEN诱导的小鼠HCC模型模拟人类HCC进程。在细胞水平，利用慢病毒介导的shRNA在多种人HCC细胞系（如HepG2, Huh7, Tong等）中敲低MED23，进行细胞活力、增殖、凋亡和ROS水平等表型分析。分子机制探索方面，采用了RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和ChIP-qPCR分析组蛋白修饰（H3K4me1, H3K27ac）和转录因子结合，双荧光素酶报告基因实验验证增强子活性，免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白质相互作用，以及蛋白质印迹（Western blot）和实时定量PCR（RT-PCR）检测基因和蛋白表达。此外，还利用了人类HCC公共数据库（如TCGA）进行生物信息学分析，以验证临床相关性。

MED23在人类HCC肿瘤中上调并对HCC细胞生长至关重要

研究人员首先通过检查已发表的HCC数据集，发现与癌旁组织相比，人类HCC肿瘤中MED23的mRNA水平显著升高，并且MED23表达增加与HCC的进展相关。HCC样本中的MED23蛋白水平也较配对非癌组织显著增加。对癌症基因组图谱（TCGA）数据库的Kaplan-Meier分析表明，高MED23表达与HCC患者较差的总生存期趋势相关。为了研究MED23的细胞功能，研究人员使用逆转录病毒介导的shRNA在人HCC细胞系中敲低MED23，并通过蛋白质印迹验证敲低效率。MED23沉默显著损害了HCC细胞的活力和增殖。流式细胞术进一步表明，MED23敲低后早期和晚期凋亡细胞均增加。这些数据表明，高MED23表达可能通过抑制凋亡和促进增殖来支持HCC发展。

Med23是小鼠模型中化学诱导HCC发展所必需的

为了在体内探索MED23在HCC发展中的作用，研究人员利用了一种基因工程小鼠模型，将Med23-floxed（med23^f/f）小鼠与Alb-cre小鼠杂交，从而在肝细胞中组成性敲除Med23。在稳态下，肝脏特异性敲除Med23（以下简称med23^Δli）的小鼠肝脏未观察到组织学异常，表明Med23对正常小鼠肝脏发育是非必需的。在出生后第14天对雄性小鼠单次注射致癌物DEN以诱导HCC发展。诱导9个月后，处死这些小鼠并进行分析。宏观检查和H&E染色显示，对照同窝小鼠（med23^f/f）产生了大量肝脏肿瘤，而med23^Δli小鼠则表现出对DEN诱导的肝脏肿瘤形成的强烈抵抗，表现为肿瘤质量、肿瘤数量和肿瘤大小显著减少。一致地，在DEN处理12个月后，Med23缺失降低了HCC生物标志物Afp和Serpina1以及纤维化标志物Col3a1的表达水平。分析分离的肿瘤中的炎症相关基因发现，与对照小鼠相比，med23^Δli小鼠的肝脏炎症减轻，表现为淋巴细胞浸润标志物Cd45和促炎因子Tnfa、Ccl5的表达水平降低。血清丙氨酸转氨酶（ALT）分泌，作为肝损伤的标志，在Med23缺失后显著降低。长期DEN暴露导致对照小鼠体重减轻并伴随肝/体比升高，这是多发性肿瘤负担的结果，而这些在Med23缺失后完全被阻止。与肝脏肿瘤发生率降低一致，经DEN处理的med23^Δli小鼠比med23^f/f小鼠表现出更长的生存期。有趣的是，当分析med23^Δli小鼠肝脏中出现的散在较小肿瘤时，发现这些肿瘤的Med23表达量约为med23^f/f小鼠肿瘤的50%，表明KO肝脏中的散在肿瘤可能是由于Med23删除不充分所致。这些数据表明，肝脏Med23失活有效阻断了化学诱导的HCC发展。

诱导性敲除Med23可减缓晚期HCC进展

肝癌发生涉及包括起始、促进和进展在内的多阶段进程。为了研究MED23在肝癌发展不同阶段的作用，研究人员将med23^f/f小鼠与可诱导的Mx-Cre转基因小鼠杂交（称为med23^*），在注射poly(I:C)后，Med23可以在肝脏和脾脏中被有效删除，但在大多数其他组织中不能。与对照小鼠相比，med23^*小鼠在短期或长期poly(I:C)注射后表现出正常发育，肝脏和体型无明显异常或缺陷。组织学分析也未发现med23^f/f和med23^*小鼠肝脏之间的可检测变化。小鼠在出生第14天腹腔注射单剂量DEN，然后在6个月时（此时癌变应处于进展期）注射poly(I:C)以诱导Med23敲除，并在9个月时评估肿瘤发展。与组成性Med23敲除相似，poly(I:C)诱导的Med23敲除显著抑制了肝癌发生，表现为med23^f/f和med23^*肝脏的代表性图像。定量分析显示，与med23^f/f小鼠相比，med23^*小鼠的肿瘤质量、肿瘤数量和肿瘤大小均减少。由于肿瘤负担减轻，med23^*小鼠也表现出较低的肝脏重量和肝/体比。正如预期，在DEN和poly(I:C)处理后，与对照小鼠相比，Med23^Δli小鼠的血清ALT、AST和T-BIL水平较低，表明肝细胞特异性Med23敲除减轻了DEN诱导的肝损伤。与在med23^Δli模型中的发现一致，尽管来自med23^*小鼠的肿瘤与来自med23^f/f小鼠的肿瘤相比Med23表达降低，但其Med23 mRNA水平仍高于周围的正常肝组织，后者几乎检测不到Med23 mRNA。这些发现表明，中介体Med23是DEN诱导的肝癌发生所必需的，突出了靶向Med23可有效阻止肝癌发展。

Med23敲除导致急性DEN处理的肝脏中凋亡增加但代偿性增殖减少

为了研究肝脏Med23敲除的细胞效应，研究人员收集了急性DEN注射后14日龄雄性小鼠的配对肝脏样本，并证实与对照肝脏相比，Med23在med23^Δli小鼠的整个肝脏中被有效删除。DEN暴露可引起肝脏DNA加合物形成和DNA损伤。与med23^f/f肝脏相比，Med23^Δli肝脏表现出加重的DNA损伤，表现为γ-H2AX染色增加。在急性注射后48小时，med23^Δli小鼠的DEN诱导的肝损伤也显著增加，表现为ALT和AST分泌增加。一致地，TUNEL检测显示，在急性DEN注射36小时后（此时细胞死亡似乎达到峰值），med23^Δli小鼠肝脏中的凋亡细胞多于med23^f/f小鼠。这些结果表明，Med23缺陷使肝细胞对DEN诱导的DNA损伤更敏感，导致凋亡增加和更严重的肝损伤。与急性模型不同，在慢性模型中，急性DNA损伤不是持续性的，因此不再是肝脏病理的主要决定因素。相反，持续的代偿性增殖导致了med23^f/f小鼠肿瘤负担增加和继发性肝损伤，从而造成ALT和AST水平升高。促炎细胞因子，包括TNFα、IL6和IL1β，主要在肝细胞死亡后由库普弗细胞产生并通过旁分泌刺激，在DEN诱导的肝癌中起关键作用。RT-PCR分析显示，急性DEN处理后，med23^f/f和med23^Δli小鼠肝脏中这些细胞因子的水平相当。类似地，已知启动肝癌发展的早期反应基因C-jun和c-fos的表达保持不变。这些结果表明，MED23敲除似乎不改变DEN诱导反应的早期阶段，但可能主要影响HCC进展的后期阶段，这意味着抑制MED23可能对晚期肝癌具有治疗益处。存活的肝细胞经历代偿性增殖以维持肝脏的稳态功能，并可能由于巨大的内在再生能力而获得致癌物诱导的突变。Ki67染色显示，与med23^f/f小鼠相比，med23^Δli小鼠中增殖的肝细胞显著减少，这通过减少的5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）掺入和组蛋白H3磷酸化染色得到进一步证实。为了进一步确定这种增殖缺陷是DEN诱导损伤特异性的，还是代表了肝细胞再生的一般性损伤，研究人员接下来应用广泛使用的三分之二部分肝切除（PH）再生模型来测试Med23是否也是肝细胞非恶性增殖所必需的。在手术后96小时，med23^Δli小鼠与med23^f/f小鼠相比表现出Ki67阳性肝细胞的适度减少。相应地，med23^Δli小鼠未能恢复。此外，med23^Δli小鼠血清ALT和AST释放增加表明肝损伤比med23^f/f小鼠更严重，这与DEN诱导的HCC模型一致。总之，这些数据与体外HCC细胞系的结果一起支持了MED23缺陷通过抑制代偿性增殖和增强肝细胞凋亡来抑制DEN诱导的HCC。

Med23^Δli肝脏在DEN处理后表现出ROS积累增加和NQO1蛋白减少

为了更好地理解Med23缺陷影响凋亡和增殖的分子机制，研究人员对急性DEN处理后48小时的对照和med23^Δli小鼠的全肝进行了全基因组转录组分析。RNA-seq数据分析鉴定出351个基因在med23^Δli肝脏中下调超过1.5倍，237个基因上调超过1.5倍。有趣的是，基因集富集分析（GSEA）显示，氧化磷酸化基因特征在Med23缺陷的肝脏中呈正富集。与这些转录组变化一致，新鲜冷冻组织切片染色显示，急性DEN处理的med23^Δli小鼠与med23^f/f小鼠相比，ROS积累增加，这通过分离的肝细胞的流式细胞术分析得到进一步证实。一致地，肝脏还原型谷胱甘肽（GSH）水平（一种主要的细胞抗氧化剂）在Med23删除后显著降低。ROS积累可诱导氧化性DNA损伤，这可以用8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）抗体特异性检测。与med23^f/f肝脏相比，Med23^Δli肝脏在急性DEN注射后显示出更高的8-OHdG染色水平，表明Med23缺陷诱导了更多的氧化性DNA损伤。与小鼠模型的结果一致，shRNA介导的MED23敲低同样增强了人HCC细胞中的ROS积累，提示MED23对ROS的细胞自主调控。环境损伤刺激的异常ROS产生可以通过激活NF-E2相关因子2（NRF2）信号通路并随后促进抗氧化基因如NQO1和HO-1的表达来解毒。研究人员发现，急性DEN处理后，与