SPOP与HAUSP通过双向调控LZTS2泛素化影响Wnt通路的新机制及其在结直肠癌中的意义

《Cell Death & Disease》：SPOP and HAUSP bidirectionally regulate LZTS2 ubiquitination to modulate the Wnt pathway

本研究聚焦结直肠癌中Wnt通路过度激活的难题，揭示了E3连接酶SPOP通过促进肿瘤抑制因子LZTS2的K48连接泛素化降解而削弱其功能，而去泛素化酶HAUSP则通过竞争性结合LZTS2并去除泛素链来稳定LZTS2。这种双向调控机制直接影响β-连环蛋白的核质分布及Wnt通路活性，为理解结直肠癌进展提供了新视角，并为针对LZTS2的靶向治疗策略开发奠定了理论基础。

　　

在恶性肿瘤的版图中，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）始终是全球范围内发病率和死亡率居高不下的健康威胁。其背后一个关键的驱动因素，是Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的异常持续激活。在正常的细胞中，β-catenin受到严密调控，当其不被需要时，会被一个名为“破坏复合体”的蛋白机器捕获并打上“降解标签”（即泛素化），最终被蛋白酶体销毁，从而阻止其进入细胞核启动促癌基因的表达。然而，在绝大多数结直肠癌中，这个精密的调控系统失灵了，导致β-catenin大量积聚并涌入细胞核，像一把始终插在启动开关上的钥匙，不断驱动着肿瘤细胞的增殖、存活和转移。

面对这一难题，科学家们将目光投向了人体内天然的“刹车”蛋白——肿瘤抑制因子。LZTS2（亮氨酸拉链肿瘤抑制因子2）就是这样一个关键角色。先前的研究表明，LZTS2能够像“锚”一样将β-catenin牢牢地固定在细胞质中，阻止其进入细胞核，从而有效抑制Wnt通路的活性，发挥抗肿瘤作用。然而，一个核心的科学问题随之浮现：LZTS2自身的“命运”——即其在细胞内的丰度和稳定性——又是如何被调控的？如果这个“刹车”本身也不稳定，那么它抑制癌症的效果就会大打折扣。理解LZTS2的稳定性调控机制，对于开发新的抗癌策略至关重要。

蛋白质的稳定性在很大程度上由泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）决定。这个系统如同细胞的“垃圾处理厂”，其中E3泛素连接酶负责给特定的蛋白质贴上“降解标签”（泛素化），而去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes, DUBs）则能反向操作，移除这些标签，从而稳定蛋白质。那么，是谁在决定LZTS2是被送上“降解之路”还是被“保护起来”？邓嫣然、谢春帆等研究人员的这项发表在《Cell Death & Disease》上的研究，为我们揭开了谜底：E3连接酶SPOP和去泛素化酶HAUSP共同扮演了LZTS2命运的“双向调节器”。

为了深入探究LZTS2的调控机制，研究人员运用了多种细胞分子生物学关键技术。他们首先在人胚胎肾细胞（HEK-293T）和结直肠癌细胞系（HCT-116, HT-29）中进行了免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质印迹（Western Blot）实验，验证了SPOP、HAUSP分别与LZTS2之间存在直接的相互作用。通过构建系列截短体突变质粒，他们精确定位了结合的关键结构域：SPOP通过其N端的MATH结构域结合LZTS2的C端，HAUSP同样通过其N端的MATH结构域结合LZTS2的C端。为了评估蛋白质稳定性，研究团队使用了蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）追踪实验来测定LZTS2的半衰期。体外泛素化实验则用于直接证实SPOP-CUL3复合物能否催化LZTS2的泛素化。此外，细胞活力与功能实验包括EdU掺入法检测细胞增殖、平板克隆形成实验评估长期增殖能力、以及Transwell小室实验分析细胞迁移能力。报告基因实验（TOP/FOP荧光素酶报告系统）和实时定量PCR（qRT-PCR）被用来评估Wnt/β-catenin通路的下游转录活性。研究人员还利用癌症基因组图谱（TCGA）的公共数据，分析了结直肠癌患者中SPOP和HAUSP的突变情况，并通过点突变质粒验证了这些突变对蛋白相互作用的影响。最后，借助AlphaFold3人工智能结构预测和PyMOL软件可视化，研究人员对SPOP、HAUSP与LZTS2的复合物结构进行了模型预测，为竞争性结合提供了结构层面的解释。

研究结果

SPOP与LZTS2相互作用并促进其泛素化降解

研究人员首先证实了SPOP与LZTS2在细胞内确实存在相互作用。无论是过表达系统还是内源性蛋白水平，在293T、HCT-116和HT-29细胞中，SPOP都能与LZTS2结合。通过结构域分析，他们发现SPOP依赖于其N端的MATH结构域来识别LZTS2的C端区域。功能上，SPOP的过表达会以剂量依赖的方式降低LZTS2的蛋白水平，而这种降解效应可以被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转，说明SPOP是通过蛋白酶体途径来降解LZTS2的。进一步研究表明，SPOP需要与其搭档CUL3形成E3连接酶复合物才能发挥作用。SPOP能够催化LZTS2发生泛素化修饰，特别是促进K48连接和K63连接的多聚泛素链的形成，其中K48连接的泛素化是蛋白质降解的典型信号。

HAUSP与LZTS2相互作用并拮抗其泛素化降解

另一方面，研究团队验证了去泛素化酶HAUSP（又称USP7）同样是LZTS2的结合蛋白。与SPOP类似，HAUSP也通过其N端的MATH结构域与LZTS2的C端结合。功能上，HAUSP的表现与SPOP截然相反：过表达HAUSP能够显著提高LZTS2的蛋白水平，并延长其半衰期；而敲低HAUSP或用其小分子抑制剂（如P22077, P5091）处理细胞，则会导致LZTS2蛋白水平的下降。重要的是，HAUSP对LZTS2的稳定作用依赖于其去泛素化酶活性，因为酶活失活的突变体（HAUSP-CA）无法稳定LZTS2。细胞泛素化实验证实，HAUSP能够有效去除LZTS2上的泛素链，包括SPOP催化的K48和K63连接链。

SPOP与HAUSP竞争性结合LZTS2以双向调控其泛素化

由于SPOP和HAUSP都结合在LZTS2的C端，且结合位点空间位置相邻，研究人员提出了竞争性结合的假设。实验证明，当HAUSP过表达时，会削弱SPOP与LZTS2的结合；反之，SPOP的过表达也会减弱HAUSP与LZTS2的结合。这种竞争直接影响了LZTS2的泛素化状态：HAUSP能够有效拮抗SPOP介导的LZTS2泛素化，而酶活失活的HAUSP-CA则无此功能。这揭示了一个动态平衡：SPOP和HAUSP通过竞争结合LZTS2的同一区域，像“拔河”一样双向调控着LZTS2的泛素化水平和稳定性。

SPOP与HAUSP通过LZTS2调控Wnt通路活性

既然LZTS2是Wnt通路的关键负调控因子，那么SPOP和HAUSP对LZTS2稳定性的影响必然会波及Wnt通路。免疫荧光实验显示，LZTS2能将β-catenin限制在细胞质，而SPOP的存在削弱了这种限制，HAUSP则增强了这种限制。报告基因实验和qRT-PCR检测下游靶基因（如Cyclin D1, AXIN2, c-Myc）表达的结果一致表明：LZTS2抑制β-catenin的转录活性，SPOP抵消了LZTS2的抑制作用，而HAUSP则增强了LZTS2的抑制作用。使用HAUSP抑制剂处理细胞，则会解除LZTS2对Wnt通路的抑制。这些结果清晰地表明，SPOP和HAUSP通过调节LZTS2的稳定性，间接而有力地调控着Wnt信号通路的开关。

SPOP与HAUSP调控LZTS2在结直肠癌中的抑癌功能

最后，研究在结直肠癌细胞模型中验证了这一调控通路的生物学意义。功能实验表明，过表达LZTS2能有效抑制HCT-116和HT-29细胞的增殖（EdU掺入和平板克隆形成实验）和迁移（Transwell实验）。当共表达SPOP时，LZTS2的这些抑癌效应被显著削弱；而当共表达HAUSP时，LZTS2的抑癌效应则被进一步加强。临床数据分析还发现，在结直肠癌患者中，SPOP的高表达与LZTS2高表达亚组患者的不良预后相关。此外，研究者在TCGA数据库中发现结直肠癌中存在SPOP（如F32L, S54T, A61T）和HAUSP（如R93Q, M102L）的突变，并证实这些突变会分别增强SPOP与LZTS2的结合或减弱HAUSP与LZTS2的结合，这可能在肿瘤发生中破坏了原有的平衡，有利于SPOP主导的LZTS2降解。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了肿瘤抑制因子LZTS2稳定性调控的一个新颖且重要的机制。SPOP作为E3泛素连接酶适配体，促进LZTS2的泛素化和降解，从而削弱其将β-catenin禁锢于胞质的能力，间接促进了Wnt通路的活性和结直肠癌的进展。相反，HAUSP作为去泛素化酶，通过竞争性结合LZTS2，去除其泛素化修饰，稳定LZTS2蛋白，进而增强其对Wnt通路的抑制和抗肿瘤功能。SPOP和HAUSP构成的这种“双向调控开关”，精细地控制着LZTS2的细胞内水平，最终影响结直肠细胞的命运。

这项研究的发现具有多重重要意义。首先，它深化了我们对Wnt通路调控网络复杂性的认识，揭示了 beyond β-catenin本身及其直接调控复合物之外的新的调控层面。其次，它提出了一个潜在的结直肠癌治疗新策略：通过靶向SPOP-HAUSP轴心来调控LZTS2的稳定性。例如，开发SPOP的抑制剂或HAUSP的激活剂，可能有助于恢复LZTS2的肿瘤抑制功能，为那些Wnt通路过度激活的结直肠癌患者提供新的治疗选择。最后，研究中发现的癌症相关SPOP和HAUSP突变如何影响其与LZTS2的相互作用，为未来实现精准医疗提供了潜在的生物标志物，有助于识别哪些患者可能从针对该轴心的治疗中获益。

总之，这项研究不仅解答了LZTS2稳定性调控的基础生物学问题，更重要的是，它将基础研究发现与癌症的病理生理过程紧密联系起来，为攻克结直肠癌这一顽疾提供了新的理论依据和潜在的干预靶点。