Sae2整合CDK与检查点激酶磷酸化信号，协同调控MRX核酸内切酶活性与Rad53检查点衰减

《Communications Biology》：Sae2 integrates CDK and checkpoint phosphorylation to coordinate MRX cleavage with checkpoint attenuation

本研究揭示了酵母Sae2如何整合CDK和检查点激酶Mec1/Tel1的磷酸化信号，以协调DNA双链断裂修复与检查点应答。研究发现，Sae2的T90/T279磷酸化通过静电相互作用抑制Rad53-Rad9结合，从而负向调控检查点；而T279与CDK磷酸化的S267协同作用，共同激活MRX复合物的核酸内切酶活性。该机制阐明了Sae2在协调DNA末端处理与检查点衰减中的核心作用，为理解基因组稳定性维持提供了新见解。

　　

在真核细胞中，DNA双链断裂（DSB）是最具危害性的DNA损伤形式之一，其修复过程必须与细胞周期检查点紧密协调，以确保基因组的稳定性。当DSB发生时，细胞会迅速启动DNA损伤检查点信号通路，通过激酶Mec1/Tel1（哺乳动物中分别为ATR/ATM）激活下游效应激酶Rad53（哺乳动物中为CHK2），诱导细胞周期停滞，为修复争取时间。与此同时，细胞会启动DNA末端切除，为同源重组（HR）修复准备单链DNA模板。这一过程由Mre11-Rad50-Xrs2（MRX）复合物启动，其核酸内切酶活性对于处理被蛋白质或共价修饰物（如发夹结构、Spo11共价复合物）阻塞的DNA末端至关重要。

Sae2（哺乳动物中为CtIP）是MRX复合物的关键辅因子，它既能刺激MRX的核酸内切酶活性，又能负向调控Rad53检查点激酶的激活。然而，Sae2如何整合来自细胞周期和DNA损伤检查点的不同信号，以协调这两项看似矛盾的功能，其分子机制尚不完全清楚。Sae2的活性受到磷酸化的精细调控：细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）在S267位点磷酸化Sae2，而检查点激酶Mec1/Tel1则在T90和T279等多个位点磷酸化Sae2。尽管这些磷酸化事件对Sae2的功能至关重要，但它们如何分别调控Sae2在检查点衰减和DNA末端处理中的具体作用，以及这些功能之间是否存在协同或拮抗关系，是领域内亟待解决的关键科学问题。

为了回答这些问题，来自米兰-比可卡大学的研究团队在《Communications Biology》上发表了题为“Sae2 integrates CDK and checkpoint phosphorylation to coordinate MRX cleavage with checkpoint attenuation”的研究论文。该研究通过结合AlphaFold3结构建模与深入的遗传学分析，揭示了Sae2通过整合CDK和检查点激酶的磷酸化信号，分别调控MRX核酸内切酶活性和Rad53检查点衰减的分子机制，阐明了Sae2在协调DNA修复与检查点应答中的核心枢纽作用。

主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 遗传学分析：构建了Sae2不同磷酸化位点的点突变体（如T90A、T279A、S267A、T90E、T279E、S267E等），并利用酵母遗传学手段分析了这些突变体在DNA损伤敏感性、发夹结构解离、减数分裂重组等方面的表型。2. 生物化学与分子生物学技术：包括蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测Rad53磷酸化水平；免疫共沉淀（Co-IP）分析Rad9与Rad53的相互作用；原位自磷酸化（ISA）实验检测Rad53激酶活性；染色质免疫沉淀（ChIP）结合qPCR分析Rad9在DSB位点的募集。3. 生物信息学分析：利用AlphaFold3对Sae2磷酸化肽段与Rad53 FHA1结构域的相互作用进行结构建模，预测了关键的相互作用界面。

研究结果

Sae2 T90和T279的磷酸化冗余地抑制Rad53-Rad9结合与Rad53激活

研究人员首先证实，Sae2的T90和T279位点对于抑制Rad53检查点激活具有冗余功能。在DNA损伤药物处理并恢复后，表达Sae2-T90A T279A双突变体的细胞表现出持续的Rad53磷酸化，而单突变体（T90A或T279A）或磷酸模拟突变体（T90E或T279E）则表现出正常的Rad53失活动力学。与此一致，Sae2-T90A T279A细胞对DNA损伤药物（如喜树碱CPT和腐草霉素phleomycin）表现出更高的敏感性。通过免疫共沉淀实验，研究人员发现，在Sae2缺失或T90A T279A双突变细胞中，即使在未受损伤的条件下，Rad53也能与Rad9发生相互作用并发生磷酸化，而在野生型或磷酸模拟突变体中则检测不到这种相互作用。这些结果表明，Sae2通过其T90和T279位点的磷酸化，负向调控Rad53与Rad9的相互作用，从而抑制Rad53的激活。

AlphaFold3建模与电荷反转遗传学揭示Sae2-Rad53相互作用的分子机制

为了阐明Sae2与Rad53相互作用的分子基础，研究人员利用AlphaFold3对Sae2磷酸化肽段与Rad53 FHA1结构域的复合物进行了结构建模。模型预测，Sae2磷酸化的T90（pT90）和T279（pT279）能够与Rad53 FHA1结构域中的R70等碱性残基形成静电相互作用。当T90被突变后，pT279与FHA1结构域结合的概率增加，这为两个位点的功能冗余提供了结构基础。为了验证这一模型，研究人员进行了电荷反转遗传学实验。他们发现，将Sae2的T90和T279突变为带正电荷的精氨酸（T90R T279R）会导致Rad53的持续激活和DNA损伤敏感性，这与Sae2缺失的表型类似。然而，当在Rad53中引入R70E突变（将正电荷反转为负电荷）时，能够抑制Sae2-T90R T279R突变体引起的Rad53过度激活和DNA损伤敏感性。这些结果有力地支持了Sae2的pT90/pT279与Rad53的R70之间通过静电相互作用介导了Sae2对Rad53的抑制作用。

Sae2 T279和S267的磷酸化协同促进MRX介导的DNA末端切割

接下来，研究人员探讨了Sae2磷酸化在调控MRX核酸内切酶活性中的作用。他们利用一个需要MRX核酸内切酶活性来解开发夹结构并产生Lys+重组体的遗传学系统。结果显示，Sae2-S267A或T279A单突变体仅表现出轻微的重组缺陷，而S267A T279A双突变体则表现出与Sae2缺失或核酸内切酶缺陷的Mre11-H125N突变体同样严重的重组缺陷。在减数分裂中，S267A T279A双突变体也表现出比S267A单突变体更严重的孢子存活率下降。此外，S267A T279A双突变体对DNA损伤药物的敏感性也显著高于S267A单突变体，且与Mre11-H125N突变体的敏感性相当。重要的是，在S267A背景下引入T279E磷酸模拟突变，或在T279A背景下引入S267E磷酸模拟突变，均不能挽救重组缺陷，表明S267和T279的磷酸化对于激活MRX核酸内切酶活性是协同且缺一不可的。

Sae2 S267/T279磷酸化的缺失不影响其抑制Rad9募集和检查点激活的功能

为了区分Sae2在DNA末端处理与检查点调控中的功能，研究人员检测了Sae2磷酸化突变体在DSB位点募集Rad9的能力。与Sae2缺失细胞不同，S267A、T279A以及S267A T279A双突变体细胞在HO内切酶诱导的DSB位点并未表现出Rad9的过度积累。相应地，这些突变体细胞在面临不可修复的DSB时，能够像野生型细胞一样发生检查点适应（adaptation），即细胞周期停滞一段时间后恢复增殖，而Sae2缺失细胞则无法适应，持续处于细胞周期停滞状态。这些结果表明，Sae2 S267和T279位点的磷酸化主要参与调控MRX的核酸内切酶活性，而不影响Sae2抑制Rad9募集和检查点激活的功能。

Sae2 T279E磷酸模拟突变部分挽救Tel1缺失细胞的DNA损伤敏感性

最后，研究人员探讨了检查点激酶Tel1是否通过磷酸化Sae2 T279来调控MRX功能。他们发现，在Tel1缺失细胞中引入Sae2-T279E磷酸模拟突变，能够部分挽救其发夹结构解离缺陷和DNA损伤敏感性。然而，Sae2-T279E突变并不能挽救Mec1缺失细胞的表型。这些结果表明，Tel1主要通过磷酸化Sae2 T279来促进MRX介导的DNA末端处理，而Mec1则可能通过其他靶点发挥作用。

结论与讨论

本研究系统性地阐明了Sae2如何整合来自CDK和检查点激酶的磷酸化信号，以协调DNA双链断裂修复与检查点应答。研究揭示了Sae2在调控Rad53检查点激活和MRX核酸内切酶活性中的双重功能，并阐明了其分子机制。

首先，研究证实Sae2的T90和T279位点被Mec1/Tel1磷酸化后，能够与Rad53的FHA1结构域结合，从而竞争性地抑制Rad53与Rad9的相互作用，进而负向调控Rad53的激活。这一机制构成了一个自我限制的回路：启动检查点信号的激酶（Mec1/Tel1）同时通过磷酸化Sae2来促进检查点的衰减，确保细胞在DNA损伤修复后能够及时恢复细胞周期进程。

其次，研究首次揭示了Sae2的T279磷酸化与CDK介导的S267磷酸化协同作用，共同促进MRX复合物的核酸内切酶活性。这两个位点的磷酸化对于激活MRX处理被阻塞的DNA末端（如发夹结构、减数分裂DSB）是缺一不可的。这一发现解释了为何CDK磷酸化是激活MRX所必需的，但仅靠CDK磷酸化又不足以完全激活其活性。

最后，研究证实Tel1激酶主要通过磷酸化Sae2 T279来促进MRX的功能，这为理解检查点激酶在DNA修复中的直接作用提供了新的视角。

综上所述，Sae2作为一个关键的整合因子，通过接收来自细胞周期（CDK）和DNA损伤（Mec1/Tel1）的不同磷酸化信号，精确地协调了DNA末端处理与检查点应答，从而在维持基因组稳定性中发挥了核心作用。