快速建立并验证一种PMAxx-RT-qPCR方法，用于检测冻干减毒甲型肝炎活疫苗（H2株）的感染滴度

《Journal of Virological Methods》：Rapid Establishment and Validation of a PMAxx-RT-qPCR Method for Infectious Titer Detection of Freeze-Dried Live Attenuated Hepatitis A Vaccine (H 2 Strain)

【字体：大中小】 时间：2025年12月25日 来源：Journal of Virological Methods 1.6

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　　快速检测肝病毒A减毒活疫苗感染滴度的PMAxx-RT-qPCR方法建立与验证。该方法通过优化PMAxx浓度、包被条件及光照参数，结合实时荧光定量逆转录PCR技术，可在一天内完成疫苗滴度检测，线性范围6.23-7.73 log10 CCID50/mL，CV值<1%，与传统细胞ELISA方法结果无显著差异（P=0.7452）。

王永荣|高幽|王伟|刘琴|李亚东|曾海源|陈丽菲|陈成|吴帆

中国云南省昆明市云南省食品药品检验研究院，邮编650106

摘要

甲型肝炎病毒（HAV）的感染滴度是评估冻干减毒活甲型肝炎（HepA-L-fd）疫苗效力的关键质量参数。在本研究中，我们开发了一种快速的PMAxx-RT-qPCR方法来检测HepA-L-fd疫苗的感染滴度。该方法能够在一天内完成病毒滴度的检测。通过对实验参数的系统性优化，我们获得了一种经过验证的方法，该方法具有出色的精确度（变异系数CV < 1%）、准确度（回收率107.6 ± 3.7%）以及6.23–7.73 log₁₀CCID₅₀/mL的线性检测范围。与传统方法的测量结果相比，六批成品疫苗之间的差异不显著（P = 0.7452）。这种优化的PMAxx-RT-qPCR方法为HepA-L-fd疫苗的感染滴度检测提供了一种快速可靠的分析手段。

引言

甲型肝炎是一种由HAV引起的急性自限性疾病，主要影响幼儿（Gholizadeh, Akbarzadeh等人，2023年）。HAV主要通过粪-口途径在人类中传播，全球每年约有150万人患有甲型肝炎（Lemon, Ott等人，2017年）。冻干减毒活甲型肝炎（HepA-L-fd）疫苗在预防和控制甲型肝炎方面发挥了积极作用（Ma, Wang等人，2022年）。HepA-L-fd疫苗的感染滴度是评估疫苗生产工艺和效力的关键质量控制参数。显然，HAV感染细胞通常不会引起细胞病变效应（CPE），因此不能仅根据CPE的存在或程度来确定病毒滴度（Brack, Frings等人，1998年；Konduru, Virata-Theimer等人，2008年）。

基于细胞的酶联免疫吸附测定（ELISA）作为中国药典（2020年版）中规定的法定方法，目前用于检测HepA-L-fd疫苗的感染滴度。然而，这种方法完成一次实验大约需要一个月的时间（McKnight和Lemon，2018年；Gholizadeh等人，2023年），并且许多干扰因素常常导致实验失败，从而影响HepA-L-fd疫苗的生产效率（de Paula等人，2009年）。因此，本研究旨在开发一种快速定量疫苗滴度的方法。

丙胺嗪单叠氮化物（PMA）是一种光敏染料，可以穿透非活性RNA病毒颗粒并与其中的RNA结合。然而，它对具有感染性的病毒颗粒没有影响（Parshionikar, Laseke等人，2010年；Sberna, Specchiarello等人，2025年）。在紫外光下，染料上的光敏叠氮基团会发生光解，生成高度活性的氮碳共价自由基。该自由基容易与核酸结合位点上的碳氢化合物形成共价键。PMA-RNA缀合物选择性地抑制qPCR反应，从而仅能检测到具有感染性的病毒颗粒（Golpayegani, Douraghi等人，2019年）。PMAxx是PMA的升级版本，具有更高的灵敏度，能够更好地区分死病毒和活病毒（Randazzo, Khezri等人，2018年；Liu, Meng等人，2022年）。目前，已有多项研究尝试应用PMA-qPCR和PMAxx-qPCR来区分具有感染性和非感染性的病毒（Karim等人，2015年；Hong等人，2021年；Razafimahefa等人，2021年；Li等人，2023年）。此外，一些研究将PMA与RT-qPCR技术结合用于HAV的检测。例如，Lian-lian, Yi-ping等人（2020年）使用PMA-PCR分析了HAV的拷贝数，但未包括感染滴度的检测。Sánchez, Elizaquível等人（2012年）开发了PMA-RT-qPCR来测量HAV的感染滴度，但该方法仅能分析浓度低于4 log₁₀CCID₅₀/mL的样本，这无法满足疫苗检测的要求。目前，应用PMA-qPCR技术检测HAV疫苗的感染滴度尚未取得成功。

本研究详细介绍了专门用于量化HAV疫苗感染滴度的PMAxx-RT-qPCR方法的开发过程。首先，我们确定了最佳的PMAxx浓度，并优化了使用PMAxx处理样本的涂层条件以及光解条件。随后，我们找到了避免稳定剂影响的最佳稀释倍数。最终，我们从准确度、精确度和特异性方面验证了所开发的PMAxx-RT-qPCR方法。建立的PMAxx-RT-PCR方案为HAV疫苗滴度的质量控制提供了一个稳健的分析平台。该方法能够在一天内快速检测病毒滴度。在测量相同批次的HAV疫苗样本时，PMAxx-RT-qPCR的结果与基于细胞的ELISA的结果没有显著差异。

材料

PMAxx（Biotium，美国加利福尼亚州），PMAxx被稀释至200μM并分装后储存在-20°C；TaKaRa MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒（Takara 9766，日本）；一步RT-qPCR试剂盒（Accurate Biology，产品编号：AG11713，中国）；样本：由中国医学科学院医学生物学研究所提供的六批冻干减毒甲型肝炎疫苗（批号：202404007K-1、202404008K-2、202405009K-1、202408017K-2、202409018K-1和202409019K-2）。

PMAxx缀合条件的优化结果

在本研究中，选择了50μM和100μM的PMAxx浓度来处理适当稀释的疫苗参考标准品。与未处理组相比，发现PMAxx处理组与未处理组之间的Ct值差异（ΔCt）很小，均小于0.5（图1a）。这一结果与Wei Hong等人的研究结果一致（Hong, Xiong等人，2021年），他们报告称当样本中的所有病毒都具有传染性时，ΔCt值差异较小。

讨论

与会导致可见细胞损伤的细胞病变病毒不同，HAV可以与宿主细胞共存而不引起CPE（Wheeler, Fields等人，1986年；Hu, Hu等人，2002年）。基于HAV的这一特性，所有获许可的HepA-L-fd疫苗生产商都选择基于细胞的ELISA（Jiang, Liao等人，2004年）作为疫苗效力分析的方法。由于HAV的复制动力学较慢（Seo, Choi等人，2025年），ELISA在早期感染阶段的灵敏度有限，需要长达一个月的细胞培养时间。

资助

本研究得到了云南省重大科技专项计划（项目编号：202002AA100008）的支持。

作者声明

我们声明本手稿是原创的，未曾发表过，也未被其他地方考虑发表。

所有作者均已阅读并批准了手稿的最终版本，并同意将其提交给《病毒学方法杂志》（Journal of Virological Methods）。我们确认所有符合作者资格的人员均被列入作者名单，且没有遗漏任何符合条件的人员。手稿中作者的顺序已经确定。

CRediT作者贡献声明

王永荣：撰写——初稿、验证、方法学、数据整理。高幽：可视化、验证、软件、方法学。王伟：撰写——初稿、可视化、验证、数据整理。刘琴：撰写——审阅与编辑、软件、方法学。李亚东：验证、方法学、正式分析、数据整理。曾海源：可视化、软件、数据整理。陈丽菲：可视化、软件、数据整理。陈成：撰写——审阅与编辑。