综述：线粒体中的ATP：定量测量、调控及生理作用

《Biochemistry (Moscow)》：ATP in Mitochondria: Quantitative Measurement, Regulation, and Physiological Role

本综述系统阐述了线粒体中ATP的定量测量方法、调控机制及其核心生理作用。文章聚焦于腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP）在线粒体基质与胞浆中的浓度差异及其相互影响，深入探讨了ATP合酶（ATP synthase）、腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）等关键蛋白的调控功能，并评述了ATeam、QUEEN等基因编码荧光传感器在ATP动态监测中的应用。文章挑战了体内存在“状态4”抑制的传统观点，强调了精确量化线粒体ATP浓度对于理解细胞能量代谢调控及相关病理生理过程的重要意义。

　　

ATP在线粒体：定量测量、调控和生理作用

线粒体作为真核细胞的“能量工厂”，其核心功能是通过氧化磷酸化合成三磷酸腺苷（ATP）。胞浆和线粒体基质中的ATP、二磷酸腺苷（ADP）和单磷酸腺苷（AMP）浓度深刻影响着从大分子生物合成、细胞分裂到离子稳态等诸多细胞过程。值得注意的是，ATP浓度的变化还会影响游离Mg²⁺的水平，从而进一步扩展其调控范围。

影响线粒体ATP浓度的蛋白质

调控线粒体基质ATP动态的两个主要“角色”是位于线粒体内膜上的ATP合酶和腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）。在人类细胞中，ANT的分子数量极为丰富，而ATP合酶的含量也相当可观。ATP合酶不仅能催化ATP合成，也能水解ATP。其活性受到MgADP复合物的非竞争性抑制（即ADP抑制）以及调节蛋白IF1的调控。IF1被认为能在能量匮乏时防止细胞ATP耗竭。

ANT对ATP和ADP具有高度特异性，其交换活动是电致性的，正常生理条件下，较高的质子驱动力（pmf）使平衡倾向于将ATP从线粒体输出到胞质。值得注意的是，ANT的转运活性会被镁离子抑制，因为核苷酸是以其游离形式而非镁复合物形式被转运的。

腺苷酸激酶（Adenylate kinases）同样影响着核苷酸浓度。位于膜间隙的AK2和位于基质中的AK3（GTP:AMP磷酸转移酶）分别催化不同的核苷酸互变反应。AK4虽可能缺乏酶活性，但在应激反应和肿瘤发生中扮演重要角色。此外，ATP-Mg²⁺/P_i载体和磷酸肌酸穿梭系统也对核苷酸动态有重要影响。

胞浆中的腺嘌呤核苷酸

在胞浆中，ATP、ADP和AMP的浓度通过腺苷酸激酶的作用维持在接近热力学平衡的状态。典型的浓度约为ATP 5 mM，ADP 0.5 mM，AMP 0.05 mM，对应的腺苷酸能量电荷（AEC）约为0.95。腺苷酸激酶反应的平衡关系导致AMP/ATP的比值与（ADP/ATP）²成正比，这使得AMP成为细胞能量匮乏的关键信号分子，并通过AMP激活的蛋白激酶（AMPK）级联反应调控细胞代谢。

线粒体中的腺嘌呤核苷酸

与胞浆相比，对线粒体基质内腺嘌呤核苷酸相互转化的了解较少。哺乳动物线粒体基质中似乎缺乏能够利用ATP再生ADP的腺苷酸激酶，但AK3可以利用GTP将AMP转化为ADP。基质内的GTP主要由TCA循环中的琥珀酰辅酶A合成酶产生。核苷二磷酸激酶（NDPKs）也影响核苷酸浓度关系，但在哺乳动物中，定位于线粒体的NDPK D主要位于膜间隙。

准确量化基质中的核苷酸浓度面临方法学挑战。高效液相色谱（HPLC）等方法能精确测量样品总核苷酸含量，但应用于完整细胞时难以区分胞浆和线粒体池。使用分离线粒体进行测量，其结果易受分离过程压力影响，且核苷酸比例（ATP约占20-75%，ADP占20-70%，AMP占3-60%）和AEC（约0.6或更低） consistently 与胞浆值不同，且ATP比例较低。

尽管如此，多种方法（如快速分馏技术、³¹P-NMR）获得的体内外数据均表明，基质中的ATP/ADP比值 consistently 低于胞浆。绝对浓度估计值范围较广（ATP 0.05-16.4 mM，ADP 0.07-14.1 mM），但总量在毫摩尔范围。这些观察结果表明，由于基质ADP缺乏而导致氧化磷酸化被抑制的所谓“状态4”，在体内生理条件下极不可能发生。因此，旨在降低pmf以限制活性氧（ROS）产生的“温和解偶联”机制，其生理作用可能需要重新评估。

荧光蛋白传感器在测量线粒体ATP浓度中的应用

基于荧光蛋白的传感器，如FRET-based的ATeam和单色传感器QUEEN、MaLion，为实时监测线粒体基质和胞浆中ATP动态提供了强大工具。ATeam传感器已成功应用于HeLa细胞、心肌细胞等，证实线粒体ATP浓度在毫摩尔范围，但通常低于胞浆，并能量化显示在缺氧、寡霉素抑制等条件下基质ATP的快速变化。

这些技术也应用于完整组织甚至整个器官，例如监测药物对心脏线粒体ATP水平的影响。在使用这些探针时，必须注意其局限性，包括对pH、离子组成、温度的敏感性，以及其他核苷酸的交叉反应性。因此，在实验体系中结合探针动态测量、传统核苷酸定量方法（HPLC、荧光素酶法）和新分析技术进行交叉验证至关重要。

结论

综上所述，在大多数情况下，真核细胞胞浆中的ATP浓度处于毫摩尔水平，而ADP和AMP浓度分别低约10倍和100倍。在线粒体基质中，ATP所占比例较低，而ADP和AMP的比例较高，这表明体内生理条件下不太可能出现因基质ADP缺乏而抑制氧化磷酸化的“状态4”。为了阐明生物能量酶活性、pmf变化以及线粒体基质和胞浆中腺嘌呤核苷酸浓度之间的因果关系，需要可靠的体内ATP浓度定量测量方法。将荧光蛋白探针的动态测量与经过严格校准的传统及新分析方法相结合，是未来深入理解线粒体能量代谢调控的关键。