《Microchemical Journal》：An electrochemiluminescence biosensor for miR-21 detection via TMSD-initiated transcription and CRISPR/Cas13a-assisted signal amplification on a Mxene-based electrode
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一种基于多级放大机制的电化学发光（ECL）miR-21传感器研究，整合了TMSD解链、T7 RNA聚合酶转录扩增和CRISPR/Cas13a侧向切割技术，通过AuNPs/Ti?C?Tx/Ru(II)-PEI修饰电极实现5.23 aM超低检测限。
梁正芳|谢云展|周洪兵|张子璐|龚远勋|张嘉毅|黄月|唐倩莉|张凯|廖先九
中国广西百色右江民族医学院附属医院，广西骨与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室，533000
摘要
microRNA-21（miR-21）是一种参与多种病理过程的关键生物标志物，但由于其在生物流体中的含量较低，导致其检测存在挑战。本文介绍了一种高灵敏度的电化学发光（ECL）生物传感器用于miR-21的检测。该系统结合了多级放大机制，包括基于toehold介导的链置换（TMSD）的初始步骤，随后通过T7 RNA聚合酶转录和CRISPR/Cas13a介导的侧向切割。传感界面通过将铁氰化物标记的DNA探针固定在导电的AuNPs/Ti?C?Tx/Ru(II)-PEI纳米杂化修饰电极上来构建。在没有miR-21的情况下，铁氰化物会有效抑制ECL信号。当目标分子被识别时，TMSD会激活分裂的T7启动子/模板系统，触发RNA转录。生成的单链RNA会激活Cas13a，从而切割DNA探针并恢复ECL信号。在优化条件下，该生物传感器的动态范围为10 aM至500 fM，检测限低至5.23 aM。此外，在加标血清样本中表现出优异的特异性、重复性（RSD = 4.3%）和回收率（99.93–106.20%）。这项工作提供了一个多功能且模块化的ECL传感平台，适用于超灵敏度的miRNA检测，在临床诊断和精准医疗领域具有广泛应用前景。
引言
microRNA（miRNAs）是一类小分子非编码RNA，在调节基因表达中起关键作用，并与多种生理和病理过程相关，包括癌症、心血管疾病和免疫反应[[1], [2], [3]]。其中，miR-21因其在一些疾病（如癌症、心血管疾病和炎症性疾病）中的表达异常而受到广泛关注[[4], [5], [6]]。准确且灵敏地检测miR-21对于早期疾病诊断、治疗监测和理解疾病机制至关重要。然而，miRNAs的含量低且长度短，使得使用传统方法难以检测到它们，因此需要开发先进的生物传感策略。
基于电化学发光（ECL）的生物传感器已成为强大的生物分子检测工具，具有高灵敏度、出色的动态范围以及与微型化平台的兼容性[[7], [8], [9]]。ECL避免了荧光技术中的光漂白和高背景信号问题，即使在低目标浓度下也能实现精确可靠的检测[[9], [10], [11]]。此外，将ECL与放大机制结合使用可以显著提升检测性能，使其成为miRNA生物传感的首选方法[[12]]。
Mxenes是一类二维材料，由于其独特的物理化学性质，在生物传感器构建领域引起了关注[[13], [14], [15], [16]]。Mxenes具有优异的导电性、较大的表面积、可调的功能基团和良好的生物相容性，为固定生物分子和促进信号转导提供了理想的平台。特别是，将AuNPs/Ti?C?Tx/Ru(II)-PEI修饰电极集成到生物传感系统中，结合了Mxenes的高导电性和基于Ru(II)的复合物的强ECL信号生成能力[[17,18]]，这种混合结构提高了ECL的效率和稳定性，非常适合构建高灵敏度和稳健的生物传感器。
基于toehold介导的链置换（TMSD）和T7 RNA聚合酶的转录放大技术已成为设计高灵敏度生物传感器的通用工具[[19], [20], [21], [22]]。TMSD可以实现可编程和特异性的目标识别，其置换反应可以精确控制以触发下游过程，即使在复杂的生物基质中也能保持优异的特异性。同时，T7 RNA聚合酶的放大能力可以从单个DNA模板转录大量RNA，从而在目标存在时实现指数级的信号放大。因此，TMSD和T7 RNA聚合酶的结合为多级信号增强提供了坚实的基础，克服了传统检测方法的灵敏度限制[[23], [24], [25], [26]]。
在本研究中，我们通过整合toehold介导的链置换（TMSD）、T7 RNA聚合酶驱动的转录、CRISPR/Cas13a侧向切割和基于Mxene的电极工程，开发了一种用于超灵敏度检测miR-21的电化学发光（ECL）生物传感器。当miR-21与P2探针杂交时，会引发TMSD反应，释放P1链并使功能性T7启动子和转录模板在原位组装。该结构作为T7 RNA聚合酶的底物，生成大量的单链RNA转录本，进而激活Cas13a，对电极上固定的铁氰化物标记的DNA报告分子进行非特异性切割[[24,27]]。去除Fc部分消除了其对ECL信号的抑制作用，显著增强了发光强度。这种级联放大策略，结合Ti?C?Tx基纳米杂化电极的高导电性和表面积，实现了miR-21的精确和选择性检测，为临床诊断和核酸生物标志物分析提供了有前景的平台。
材料与化学试剂
本研究中使用的所有寡核苷酸均由Genscript Biotechnology Co., Ltd.（南京，中国）合成，其序列见表S1。CRISPR/Cas13a酶购自New England BioLabs（NEB，上海，中国）。分析级试剂（包括N-(3-(dimethylamino)propyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)、N-hydroxysuccinimide (NHS)和triethylamine）购自Aladdin Reagent Co.（上海，中国）。
所提出的ECL生物传感器的原理
所提出的生物传感器采用多级放大机制，将目标miRNA的存在转化为增强的电化学发光（ECL）信号（图1）。最初，生物传感器处于非活性状态，因为P1和P2探针杂交形成了一个刚性双链结构，这种结构阻止了T7 RNA模板和T7启动子的两个分离片段（分别位于P1的两端）发生杂交。同时，DNA报告探针（DNA1）
结论
本研究开发了一种高灵敏度和特异性的电化学发光（ECL）生物传感器，用于miR-21的检测，结合了多级放大策略，包括toehold介导的链置换（TMSD）、T7 RNA聚合酶转录放大和CRISPR/Cas13a侧向切割。通过使用AuNPs/Ti?C?Tx/Ru(II)-PEI修饰电极和铁氰化物修饰的DNA探针，该生物传感器实现了卓越的性能，检测限低至5.23 aM。
CRediT作者贡献声明
梁正芳：方法学研究。谢云展：可视化分析、验证。周洪兵：数据管理、概念设计。张子璐：软件开发、资源协调。龚远勋：软件开发、资源支持。张嘉毅：软件开发、项目管理。黄月：资源管理、项目协调。唐倩莉：数据管理、概念设计。张凯：方法学研究。廖先九：资金获取、数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（编号82260887）、广西自然科学基金（编号2025GXNSFHA069115）、生命科学分析化学国家重点实验室（编号SKLACLS2314）、广西骨与关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（编号21-220-06-202205）、百色生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室（编号2022-38-05）的财政支持。
