哺乳阶段、母亲年龄与胎次对新鲜乳汁中乳腺上皮细胞群体的影响研究

《Scientific Reports》：Impact of lactation stage, maternal age, and parity on mammary epithelial cell populations in fresh milk

本研究针对哺乳期乳腺上皮细胞(MEC)群体特征受母体因素影响尚不明确的问题，系统分析了127份母乳样本。研究发现，哺乳阶段是MEC特性的主要决定因素：随哺乳进展，细胞总数下降而上皮细胞比例增加，PRLR表达上调；母亲年龄增长与上皮细胞比例降低和体外增殖能力减弱相关；多胎次与体外培养细胞中管腔细胞富集相关。该研究确立了母乳作为非侵入性上皮细胞来源的价值，为哺乳生物学和乳腺癌风险研究提供了新见解。

　　

乳汁，这种被誉为“液体黄金”的天然营养品，其奥秘远不止于已知的蛋白质、脂肪和碳水化合物。事实上，每一滴母乳中都包含着来自母亲乳腺的活细胞——乳腺上皮细胞(Mammary Epithelial Cells, MECs)。这些细胞如同微小的信使，从活跃的乳腺组织中脱落进入乳汁，为科学家们提供了一个独一无二、非侵入性的窗口，用以窥探人体哺乳期乳腺的真实状态。理解这些细胞的特性，对于揭示哺乳生物学、乳腺发育乃至乳腺癌的起源都具有重要意义。然而，一个核心问题尚未被系统解答：这些随着乳汁排出的细胞，其数量、类型和功能是否会随着母亲的哺乳阶段、年龄以及生育胎次的不同而发生变化？

以往，获取用于研究的人体乳腺上皮细胞十分困难，大多来源于乳房缩小手术等途径，但这些样本通常处于非哺乳的静止期，难以反映怀孕、哺乳等活跃阶段的动态变化。尽管已有研究证实母乳中的细胞可以被分离并在体外培养，成为研究泌乳乳腺生物学的模型，但关于母体因素如何影响这些细胞群体的系统研究仍存在空白。特别是，这些因素与乳腺癌风险的潜在关联，更增加了这一研究课题的紧迫性和价值。

为了填补这一知识空白，由Marion Salmon-Legagneur和Gaelle Neveu等人组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们建立了一个包含127份母乳样本的生物样本库，这些样本来自119位不同的哺乳母亲。研究团队旨在系统性地探究哺乳阶段（早、中、晚期）、母亲年龄（≤30岁、31-35岁、≥36岁）和胎次（1胎、2胎、≥3胎）这三个关键母体因素，如何影响乳汁来源MECs的丰度、表型（如管腔细胞和基底细胞的比例）以及功能特性（如增殖潜力和泌乳相关基因表达）。这不仅包括对刚分离的新鲜细胞进行分析，还创新性地进行了长达21天的体外培养，以评估这些细胞在扩增后的特性变化。

研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们从巴黎地区招募的119位捐赠者处收集了127份母乳样本，建立了研究队列。通过密度梯度离心法从乳汁中分离出细胞，并使用吖啶橙/碘化丙啶染色进行活细胞计数。利用流式细胞术，通过CD45、CD31、CD235a等抗体排除非上皮细胞，并利用CD49f（基底细胞标志物）和EpCAM（管腔细胞标志物）对上皮细胞进行分型。将分离的细胞在涂有层粘连蛋白521的板上使用商品化的EpiPlus培养基进行21天的体外培养，评估其集落形成能力和增殖情况。通过RT-qPCR技术检测新鲜细胞和培养后细胞中泌乳相关基因（如LALBA、CSN2、PRLR等）的表达水平。使用BCA法和商品化ELISA试剂盒对细胞去除后的乳汁上清液中的总蛋白及特定乳蛋白（乳铁蛋白、α-乳清蛋白、β-酪蛋白）进行定量。

上皮细胞分离后的分析

研究发现，乳汁中的总细胞浓度随着哺乳阶段的推进而显著下降，从产后第一个月的平均0.157 x 10⁶个/毫升降至哺乳晚期（≥4个月）的0.046 x 10⁶个/毫升，而母亲年龄和胎次对总细胞浓度没有显著影响。通过对新鲜分离的细胞进行流式细胞术分析，发现上皮细胞（CD49f⁺或EpCAM⁺）在总细胞中占比较低（<10%），且该比例随母亲年龄增长有下降趋势。基因表达分析显示，随着哺乳进展，上皮细胞标志物CD24和KRT14的表达上调，尤为重要的是，泌乳功能的关键调节因子——催乳素受体(Prolactin Receptor, PRLR)的表达显著增加了3倍。此外，PRLR的表达随着母亲年龄的增长而显著降低（3倍），提示年龄可能影响乳腺上皮对催乳素的反应性。胎次对新鲜分离细胞的表型没有显著影响。

体外培养21天后上皮细胞群体的分析

体外培养实验成功地从超过70%的捐赠者乳汁中培养出细胞。虽然集落形成能力在各组间无统计学显著差异，但趋势上显示早期哺乳（≤1个月）和年轻母亲（≤30岁）的样本更易形成集落。更重要的是，来自超过35岁母亲的细胞，在培养21天后的累计细胞数量显著低于31岁以下的母亲，表明其增殖潜力随年龄增长而减弱。哺乳阶段和胎次对细胞增殖能力无显著影响。流式细胞术分析培养21天后的细胞发现，哺乳阶段影响了上皮细胞亚型的比例：晚期哺乳样本显示出更高的成熟管腔细胞（CD49f^neg/EpCAM^bright）比例。胎次的影响在培养后变得明显：与只有一胎的母亲相比，有过两胎及以上生育史的母亲，其细胞在培养后呈现出更高的管腔细胞与基底细胞比例，即 luminal-to-basal ratio 升高。免疫荧光染色（CK8/CK14）直观地证实了这些表型差异。基因表达分析进一步支持了表型结果：晚期哺乳样本的细胞高表达管腔细胞标志物（KRT19）和泌乳相关基因（LALBA, LTF）；而多胎次母亲的细胞也显示出LALBA和LTF表达升高的趋势。

新鲜乳汁中主要乳汁成分的分析

对新鲜分离细胞的分析发现，所有检测的主要乳蛋白基因（LTF, LALBA, CSN1S1, CSN2, CSN3）的表达量在哺乳过程中均显著增加（约3倍），表明尽管晚期乳汁细胞数量减少，但存留的细胞其泌乳相关转录活性更强。对乳汁上清液的生化分析则显示，总蛋白浓度随哺乳进展而下降，这与普遍认知一致。然而，通过ELISA定量检测特定的乳蛋白（乳铁蛋白、α-乳清蛋白、β-酪蛋白）浓度，却发现它们在哺乳各阶段、不同母亲年龄和胎次组间均无显著变化。

本研究得出结论，哺乳阶段、母亲年龄和胎次这三个母体因素显著塑造了母乳中乳腺上皮细胞的丰度、表型和功能特性。哺乳阶段是主要决定因素，伴随哺乳进展，细胞总数下降，但上皮细胞比例和泌乳功能专业化程度提升，PRLR表达上调可能是一种维持泌乳的补偿机制。母亲年龄增长与上皮细胞比例降低和体外增殖能力减弱相关，提示年龄相关的乳腺组织动态变化或细胞内在老化。胎次，特别是多胎次，与体外培养细胞中管腔细胞的富集相关，这支持了生殖史对乳腺上皮细胞身份产生持久“表观遗传印记”的假说，可能与已知的妊娠导致的DNA甲基化稳定改变有关。

该研究的重要意义在于，它首次系统性地揭示了母体因素对乳汁来源MECs特性的影响，并强调了在利用这些细胞进行研究时必须考虑母体背景。通过成功的体外培养模型，研究不仅验证了新鲜细胞的表型趋势，还放大了在培养前不明显的差异（如胎次对细胞亚型的影响），为后续研究提供了强大工具。这项工作确立了母乳作为一种宝贵、非侵入性的原发性乳腺上皮细胞来源的地位，为在生理相关背景下研究人类乳腺生物学、上皮细胞可塑性以及乳腺癌风险相关的细胞环境开辟了新的道路。未来，整合更深入的表观遗传学、转录组学分析，并结合3D培养模型，将进一步揭示这些母体因素影响乳腺上皮细胞的分子机制。