mRNA脂质纳米颗粒介导的腹腔内定制化CAR巨噬细胞编程：重塑肿瘤微环境并增强癌症免疫治疗

《Nature Communications》：Intraperitoneal programming of tailored CAR macrophages via mRNA lipid nanoparticle to boost cancer immunotherapy

针对腹膜转移瘤缺乏有效疗法的临床难题，研究人员开发了一种靶向巨噬细胞的mRNA-LNP递送系统，通过腹腔注射在体内原位编程CAR-M。研究发现，定制的CD3ζ/TLR4 CAR-M能重塑免疫抑制性TME，上调MHC-I和PD-L1，并富集TCF1+PD-1+祖细胞耗竭CD8+T细胞，从而与PD-1/L1免疫检查点阻断疗法产生强大的协同效应，为实体瘤治疗提供了新策略。

　　

腹膜转移是实体瘤治疗中一个棘手的临床难题。传统的细胞减灭术联合腹腔热灌注化疗仅对少数肿瘤负荷极小的患者有益，而对于大多数晚期患者而言，这并非一个可行的临床选择。免疫疗法虽然前景广阔，但腹膜肿瘤往往能发展出逃避免疫系统的机制，导致疾病进展和不良预后。因此，探索针对腹膜转移的替代性免疫疗法迫在眉睫。

与此同时，腹膜转移患者的腹水中含有大量的免疫细胞，其中巨噬细胞约占45%。在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞大致分为促炎性的M1样或促肿瘤的M2样，其浸润程度与患者预后不良和免疫治疗耐药密切相关。因此，改变巨噬细胞的表型或功能以增强对实体瘤的免疫反应，成为当前研究的热点。

嵌合抗原受体巨噬细胞作为一种新兴的细胞疗法，在临床前实体瘤模型中展现出强大的吞噬活性和肿瘤穿透能力。然而，类似于FDA批准的CAR-T细胞，CAR-M的制备过程复杂且昂贵，加之病毒载体介导的细胞工程存在致瘤风险，限制了其更广泛的临床应用。因此，研究人员开始尝试通过构建非病毒纳米载体，直接在体内生成CAR-M来治疗实体瘤。

此外，考虑到静脉输注相关的代谢分布障碍和复杂性，研究人员推测，通过腹腔注射mRNA-LNP进行CAR-M治疗可能是一种更可行的方式。目前，关于巨噬细胞CAR胞内结构域的研究主要集中在CD3ζ信号转导上，但仅依赖CD3ζ远未充分利用巨噬细胞的多功能特性。巨噬细胞通过一系列天然受体感知并响应外部信号，执行吞噬、免疫调节和抗原呈递等多方面作用。因此，系统性地研究巨噬细胞中不同信号通路在CAR模式下的合理设计、组合及生物学效应，对于开发更有效的CAR-M疗法至关重要。

为了回答这些问题，来自中国科学院杭州医学研究所、上海交通大学医学院附属仁济医院分子医学研究院等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了题为“Intraperitoneal programming of tailored CAR macrophages via mRNA lipid nanoparticle to boost cancer immunotherapy”的研究论文。该研究开发了一种靶向巨噬细胞的mRNA-LNP递送系统，通过腹腔注射在体内原位编程CAR-M，并系统评估了36种不同胞内结构域组合的CAR-M功能。研究发现，定制的CD3ζ/TLR4 CAR-M能重塑免疫抑制性TME，上调MHC-I和PD-L1，并富集TCF1⁺PD-1⁺祖细胞耗竭CD8⁺T细胞，从而与PD-1/L1免疫检查点阻断疗法产生强大的协同效应，为实体瘤治疗提供了新策略。

关键方法

研究人员首先构建了包含不同胞内结构域（如CD3ζ、Dectin1、CD40、TLR4等）的CAR-mRNA，并开发了一种包含磷脂酰丝氨酸和β-谷甾醇的巨噬细胞靶向mRNA-LNP递送系统。在体外实验中，他们利用该递送系统将CAR-mRNA转染至巨噬细胞，通过流式细胞术、共聚焦成像、RNA测序、ELISA和共培养杀伤实验等，系统评估了不同CAR-M的吞噬功能、细胞因子分泌及基因表达谱。在体内实验中，他们建立了CT26和PAN02两种同源小鼠腹膜转移瘤模型，通过腹腔注射CAR-mRNA LNP，利用活体成像、流式细胞术、单细胞RNA测序、免疫荧光染色和ELISPOT等技术，评估了CAR-M在体内的靶向性、抗肿瘤疗效、对免疫微环境的重塑作用及其与PD-1抗体的协同效应。

研究结果

1. CAR-M的功能设计与优化

研究人员开发了一种包含磷脂酰丝氨酸和β-谷甾醇的mRNA-LNP递送系统，该系统能高效地将mRNA转染至多种巨噬细胞。通过流式细胞术和共聚焦成像验证了CAR在巨噬细胞膜上的成功表达。功能实验表明，CD3ζ和Dectin1 CAR-M能以效应细胞与靶细胞比例依赖的方式有效吞噬肿瘤细胞，而CD40和TLR4 CAR-M则能显著诱导促炎细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的释放。RNA测序分析显示，CD3ζ和Dectin1 CAR-M具有相似的基因特征，而CD40和TLR4 CAR-M则聚为一类，且CD40和TLR4组中IL-12基因表达显著上调。为了增强抗肿瘤性能，研究人员进一步优化了CAR结构，发现将CD47的高亲和力配体SIRPα突变体作为CAR的胞外识别域，能有效阻断CD47-SIRPα轴，显著增强CAR-M的吞噬能力。

2. 通过mRNA PSβ-LNP进行腹腔内CAR-M编程

在CT26结肠癌同源小鼠腹膜转移模型中，研究人员验证了GFP-mRNA PSβ-LNP对巨噬细胞的核酸递送能力。结果显示，在恶性腹水中，PSβ-LNP组中超过60%的巨噬细胞为GFP阳性，表明单次给药后18小时内即可实现高效转染。免疫荧光切片显示，eGFP表达广泛出现在肿瘤内部及周边的巨噬细胞中。DIR标记的PSβ-LNP在腹腔注射后主要富集于肿瘤团块和肝脏，在腹腔外其他器官中分布极少。在CT26-luc同源小鼠模型中，CD3ζ CAR-M和Dectin1 CAR-M均表现出强大的肿瘤抑制能力，并显著延长了荷瘤小鼠的生存期。在巨噬细胞被氯膦酸盐脂质体预先清除后，CAR-mRNA PSβ-LNP的治疗效果被消除，证实了巨噬细胞在体内CAR-M编程中的关键作用。

3. CAR-M激活适应性免疫系统并增敏aPD-1治疗

为了评估CAR-M干预对免疫系统的影响，研究人员对经CAR-M治疗后达到肿瘤完全清除的小鼠进行了肿瘤再攻击实验。结果显示，这些小鼠再次表现出完全的肿瘤抑制，证实了小鼠体内建立了全面的适应性免疫保护。ELISPOT实验表明，治愈小鼠脾脏中肿瘤特异性T细胞数量显著增加，且将治愈小鼠的脾细胞过继转移至初始小鼠体内，能显著抑制肿瘤生长。研究人员进一步将具有促炎特性的CD40或TLR4 CAR与促进吞噬的CD3ζ CAR进行组合，构建了平行CAR。在免疫健全小鼠模型中，平行CAR（CD3ζ/CD40或CD3ζ/TLR4）表现出更强的肿瘤抑制效果，并能有效激活适应性免疫系统，促进巨噬细胞维持M1表型。值得注意的是，在通常对PD-1抗体不敏感的CT26小鼠模型中，PD-1抗体与CAR-M联合治疗在短期内几乎完全清除了肿瘤，并显著提高了小鼠的生存率。在PAN02胰腺癌模型中，CAR-M单药治疗也表现出强大的肿瘤清除能力，且与PD-1抗体联合治疗能进一步延缓肿瘤复发并显著延长总生存期。

4. CAR-M与ICB的协同作用机制

为了阐明CAR-M与PD-1/L1 ICB疗法之间的相互作用，研究人员对CT26小鼠同源肿瘤模型治疗过程中的免疫细胞进行了单细胞RNA测序分析。结果显示，CAR-M和联合治疗组中T细胞和粒细胞比例增加，而巨噬细胞群比例下降。巨噬细胞簇1在CAR-M和联合治疗组中占主导地位，该簇表现出最高的M1评分和最低的M2评分，且PD-L1基因显著上调。同时，研究人员观察到巨噬细胞中MHC I分子及其相关基因表达显著上调，这可能通过抗原交叉呈递促进CD8⁺T细胞的浸润。机制研究表明，CAR信号转导通过激活NF-κB通路，上调了PD-L1和MHC I的表达。虽然MHC I的上调可以增强免疫治疗的疗效，但其完全的治疗潜力可能依赖于同时阻断PD-L1。此外，T细胞分析显示，CAR-M和联合治疗组中富集了终末耗竭T细胞、增殖性T细胞和祖细胞耗竭T细胞，其中Tpex群体的形成对于PD-1 ICB的疗效至关重要。

结论与讨论

该研究开发了一种mRNA-LNP递送系统，用于在晚期腹膜播散性肿瘤中进行高效的腹腔内定制化CAR-M编程。原位编程的CAR-M，特别是平行CAR-M，展现出广阔的治疗前景，与传统ICB疗法产生强大的协同效应，具有显著的临床转化潜力。研究发现，CAR信号转导通过激活NF-κB通路，上调了MHC I和PD-L1的表达。MHC I的上调使肿瘤细胞对T细胞依赖性杀伤敏感，而巨噬细胞上pMHC的呈递是T细胞活化的主要事件。同时，原位制备的CAR-M上的PD-L1对于充分的T细胞活化也至关重要，这强调了将CAR-M与PD-1 ICB疗法联合的必要性。此外，研究证实，平行CD3ζ/TLR4 CAR-M与PD-1抗体联合，相比近期报道的CD3ζ CAR-M与PD-1抗体联合，能维持更高的M1巨噬细胞群并实现更强的T细胞动员。为了优化吞噬作用，将CD47阻断整合到CAR胞外域中，显著增强了吞噬能力，且观察到的血液毒性可控。尽管在过量抗原刺激下，CAR在巨噬细胞中的表达会下调，但该研究为通过单次CAR-mRNA LNP给药实现长期CAR表达提供了重要的结构优化方向。总之，这项研究不仅为腹膜转移瘤提供了一种有前景的治疗策略，也拓宽了人们对CAR-M疗法调控和反馈机制的理解。