亚毒性离子液体诱导巨噬细胞样细胞自噬与细胞骨架重塑的力学机制研究

《Cell Reports Physical Science》：Biomechanics of macrophage-like cells exposed to subtoxic concentrations of ionic liquids

本研究针对室温离子液体(RTILs)在生物医学应用中潜在的安全性问题，系统评估了亚毒性浓度RTILs对THP-1巨噬细胞样细胞的生物力学影响。研究发现，RTILs暴露导致细胞杨氏模量显著降低，细胞骨架肌动蛋白和微管蛋白重组，并激活自噬通路。该研究揭示了免疫细胞通过自噬和细胞骨架重塑来适应RTILs诱导的应激，为设计更安全的离子液体基生物医学应用提供了关键见解。

　　

室温离子液体(RTILs)因其独特的物理化学性质，在绿色化学、生物医学和材料科学等领域展现出巨大的应用潜力。然而，随着其应用的日益广泛，RTILs对生物系统的潜在毒性也引发了广泛关注。尽管已有研究揭示了RTILs在高浓度下的细胞毒性，但其在亚毒性浓度下，特别是对免疫系统关键细胞——巨噬细胞的生物力学影响及其内在机制，仍是一个亟待探索的“黑箱”。理解细胞如何从力学层面响应这些外来物质，对于评估其生物相容性、开发安全的药物递送系统以及设计新型生物材料至关重要。

为了填补这一知识空白，来自深圳大学、中国科学院深圳先进技术研究院等机构的研究团队在《Cell Reports Physical Science》上发表了题为“Biomechanics of macrophage-like cells exposed to subtoxic concentrations of ionic liquids”的研究论文。该研究以THP-1巨噬细胞样细胞为模型，系统探究了三种咪唑类RTILs在亚毒性浓度下对细胞生物力学性质、细胞骨架结构及细胞命运的影响，揭示了细胞通过自噬和细胞骨架重塑来适应RTILs诱导的应激，为RTILs的安全应用提供了重要的科学依据。

关键技术方法

本研究采用多学科交叉的技术手段，系统评估了RTILs的亚毒性效应。首先，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)测定细胞活力，确定了三种RTILs（[C₄MIM][Cl]、[C₈MIM][Cl]和[C₁₂MIM][Cl]）的半致死浓度(LC₅₀)，并选择1/2 LC₅₀作为后续实验的亚毒性暴露浓度。核心的生物力学表征采用原子力显微镜(AFM)，利用球形探针在力映射模式下，结合修正的Hertz模型，定量测量了细胞的杨氏模量、粘附力及形态学参数。细胞骨架和自噬通路的可视化则通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)实现，分别对肌动蛋白、微管蛋白、自噬体(LC3B)和溶酶体进行荧光染色和定量分析。此外，研究还利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了炎症因子和抗炎因子的分泌水平，以评估免疫反应；并采用拉曼光谱技术探索了RTILs在细胞内的分布。

研究结果

Cytotoxicity of RTILs

研究首先通过CCK-8实验确定了三种RTILs对THP-1巨噬细胞样细胞的LC₅₀值。结果显示，随着烷基链长度的增加，RTILs的毒性显著增强，其中[C₁₂MIM][Cl]的LC₅₀最低，仅为0.97±0.08 μM，而[C₄MIM][Cl]的LC₅₀则高达17100±400 μM。基于此，研究人员选择1/2 LC₅₀作为后续所有实验的暴露浓度，以确保实验条件处于亚毒性范围。

Biomechanical changes triggered by RTILs

AFM分析揭示了RTILs暴露对细胞形态和力学性质的显著影响。形态学图谱显示，与铺展良好的对照组细胞相比，RTILs处理后的细胞变得更加圆润，接触面积减小。力学图谱则呈现出明显的颜色偏移，表明细胞硬度降低。定量分析证实，RTILs暴露导致细胞的杨氏模量显著下降，表明细胞发生了软化。这种软化现象在浅层压痕（0%-30%，主要反映肌动蛋白皮层）和深层压痕（70%-100%，主要反映微管蛋白网络）中均被观察到，提示细胞骨架的整体结构完整性受到了影响。同时，细胞与探针之间的非特异性粘附力也发生了改变。

Cytoskeleton reorganization induced by RTILs

为了探究力学性质变化的分子基础，研究人员利用CLSM观察了细胞骨架的重组。结果显示，与对照组相比，RTILs处理后的细胞中，肌动蛋白和微管蛋白的荧光信号强度均显著降低，表明这两种细胞骨架蛋白发生了去聚合或重组。此外，在RTILs处理的细胞中，观察到了大量被肌动蛋白包裹的囊泡结构，这提示细胞骨架的重组伴随着囊泡运输过程的改变。

Autophagy activation

鉴于细胞骨架与自噬过程密切相关，研究人员进一步检测了自噬通路的激活情况。CLSM成像和定量分析显示，RTILs处理显著增加了自噬体(LC3B)和溶酶体(LysoTracker)的信号强度，表明自噬过程被激活。拉曼光谱分析也发现，RTILs处理后的细胞内囊泡区域具有更强的拉曼信号，这进一步支持了自噬体/溶酶体等囊泡结构增多的观察结果。

Artificial induction of autophagy

为了验证自噬在细胞适应RTILs应激中的保护作用，研究人员使用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)进行了干预实验。结果显示，雷帕霉素预处理能够使细胞对[C₈MIM][Cl]的LC₅₀值从600±40 μM提高至705±42 μM，表明自噬的激活增强了细胞对RTILs的耐受性。AFM分析发现，雷帕霉素处理同样导致了细胞杨氏模量的显著降低，且CLSM观察到了与RTILs处理相似的细胞骨架重组和自噬体形成，这进一步证实了自噬与细胞力学性质改变之间的关联。

Cytokine production

为了评估RTILs暴露是否引发了免疫反应，研究人员检测了细胞上清液中炎症因子和抗炎因子的水平。ELISA结果显示，在亚毒性浓度下，RTILs处理并未显著诱导炎症因子(TNF-α和IL-1β)的分泌，同时抗炎因子(IL-1Ra和IL-10)的水平也未发生显著变化，表明RTILs在亚毒性浓度下并未引发强烈的免疫激活或抑制。

ROS assay

活性氧(ROS)检测结果显示，在24小时的RTILs暴露后，细胞内的ROS水平与对照组相比没有显著差异，表明在亚毒性浓度下，RTILs并未引起显著的氧化应激。

结论与讨论

本研究系统揭示了亚毒性浓度RTILs对巨噬细胞样细胞的生物力学影响及其内在机制。研究结果表明，RTILs暴露导致细胞发生显著的力学软化，表现为杨氏模量的降低，这一变化与细胞骨架（肌动蛋白和微管蛋白）的重组密切相关。同时，细胞通过激活自噬通路来应对RTILs诱导的应激，自噬的激活不仅表现为自噬体和溶酶体数量的增加，还被证明能够增强细胞对RTILs的耐受性。重要的是，在亚毒性浓度下，RTILs并未引发强烈的炎症反应或氧化应激，这提示细胞通过一种非炎症性的、以细胞骨架重塑和自噬激活为特征的适应性机制来维持稳态。

该研究首次将RTILs的生物效应与细胞生物力学和自噬通路联系起来，为理解RTILs与免疫细胞的相互作用提供了新的视角。这些发现不仅深化了我们对RTILs生物安全性的认识，也为设计更安全、更有效的离子液体基生物医学应用（如药物递送、免疫佐剂等）提供了重要的理论依据和实验基础。