水稻CCCH串联锌指蛋白OsTZF1通过调控Piz-t介导的抗病性平衡基础免疫与特异性免疫

《Plant Communications》：The CCCH-tandem zinc-finger protein OsTZF1 positively regulates basal immunity but suppresses Piz-t-mediated blast resistance in rice

本研究聚焦于植物NLR免疫受体表达调控机制不清的科学问题，研究人员围绕水稻CCCH串联锌指蛋白OsTZF1开展免疫调控机制研究，发现OsTZF1通过结合AAAGC motif正向调控OsSGT1和OsKS4等防御基因表达增强基础免疫，但直接抑制Piz-t转录而负调控其介导的抗稻瘟病能力。敲除OsTZF1可显著提高Piz-t蛋白水平，拓宽对毒性菌株的抗性而不影响水稻生长，为作物抗病育种提供了新策略。

　　

在植物与病原菌的长期共进化过程中，植物形成了复杂而精密的免疫防御系统。这一系统至少包含两个层次：由病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）和由效应子触发的免疫（ETI）。其中，核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）受体蛋白在ETI中扮演着“哨兵”角色，能够特异性识别病原菌效应子，从而激活强烈的免疫反应。然而，NLR蛋白的表达如何被精确调控，以及如何平衡抗病性与植物生长发育之间的关系，仍是植物免疫领域亟待解决的关键科学问题。

水稻作为全球最重要的粮食作物之一，常年受到稻瘟病的严重威胁，由稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）引起的这种病害可导致大幅减产。水稻NLR抗病蛋白Piz-t能够赋予水稻对稻瘟菌的广谱抗性，但其调控机制尚不完全清楚。先前研究表明，E3泛素连接酶APIP10能够负调控Piz-t的积累，但两者之间并不直接相互作用，暗示存在中间调控因子。为了揭示APIP10与Piz-t之间的调控桥梁，并深入理解水稻免疫平衡机制，中国农业科学院植物保护研究所宁跃思研究员团队在《Plant Communications》上发表了最新研究成果。

研究人员主要运用了酵母双杂交（Y2H）筛选、免疫共沉淀（Co-IP）、基因编辑（CRISPR/Cas9）、定量逆转录PCR（qRT-PCR）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因（dual-LUC）等关键技术方法。其中，酵母双杂交筛选以APIP10为诱饵，发现了与其互作的OsTZF1蛋白；通过CRISPR/Cas9技术在NPB背景的Piz-t-HA转基因植株和栽培品种ZH11背景中构建了OsTZF1敲除突变体；利用EMSA和ChIP-qPCR等技术验证了OsTZF1与靶基因启动子的直接结合作用。

OsTZF1与APIP10和Piz-t互作并正向调控水稻抗病性

通过酵母双杂交筛选，研究人员发现CCCH串联锌指蛋白OsTZF1与APIP10存在相互作用，并通过免疫共沉淀实验在体内验证了这一互作。然而，APIP10并不能促进OsTZF1的降解。功能分析表明，在感病水稻品种日本晴（NPB）背景下，降低OsTZF1表达（RNAi）使水稻对稻瘟菌毒性菌株RB22和RO1-1更敏感，而过表达OsTZF1则增强抗病性，表明OsTZF1正向调控水稻基础免疫。

OsTZF1增强OsSGT1和OsKS4的转录水平

OsTZF1定位于细胞质和细胞核，其拟南芥同源蛋白AtTZF1已被证实可结合DNA和RNA。研究人员通过qRT-PCR筛选发现，OsTZF1过表达显著上调了防御相关基因OsSGT1和OsKS4的表达。生物信息学预测和实验验证（EMSA、dual-LUC、ChIP）表明，OsTZF1通过结合OsSGT1和OsKS4启动子区的AAAGC motif，从而激活这些基因的转录。OsSGT1参与水杨酸（SA）代谢，OsKS4则参与防御化合物合成，二者在抗病中起关键作用。

在Piz-t背景下敲除OsTZF1增强对毒性菌株的抗性

酵母双杂交和免疫共沉淀实验证实OsTZF1与Piz-t的NT和NBS结构域相互作用。在含有Pizt-HA的转基因水稻中敲除OsTZF1后，植株对携带AvrPiz-t的无毒菌株RO1-1的抗性水平与Piz-t-HA植株相当，表明敲除OsTZF1不影响Piz-t介导的ETI抗性。然而，当接种不携带AvrPiz-t的毒性菌株RB22、CHE86和GZ8时，ostzf1/Piz-t-HA突变体表现出更小的病斑和更低的真菌生物量，即抗性增强。进一步分析发现，突变体中Piz-t的转录和蛋白水平均显著升高。田间农艺性状调查表明，ostzf1突变并未引起生长损失。

OsTZF1抑制Piz-t的转录水平

序列分析发现Piz-t的启动子和编码区存在多个AAAGC motif（M1, M2）。EMSA显示OsTZF1能结合这些 motif。ChIP实验证实OsTZF1在体内可富集于Piz-t的启动子区域。双荧光素酶报告基因实验揭示，仅由Piz-t启动子驱动报告基因时，OsTZF1的调控作用不显著；而当报告基因由启动子加上405 bp的编码区（Piz-tproP）驱动时，OsTZF1显著抑制了荧光素酶活性，表明OsTZF1通过结合编码区内的AAAGC motif（M2）来抑制Piz-t的转录。

在栽培品种ZH11背景下敲除OsTZF1增强抗性且无生长代价

为了验证OsTZF1敲除策略在生产品种中的应用潜力，研究人员在含有内源Piz-t基因的栽培品种ZH11中创建了ostzf1突变体。与在转基因背景下的结果一致，ostzf1/ZH11突变体中Piz-t转录水平升高，并对多个稻瘟菌毒性菌株表现出增强的抗性，同时主要农艺性状与ZH11相比无显著差异，进一步证实了敲除OsTZF1在平衡抗病性与生长发育方面的应用价值。

本研究系统阐明了OsTZF1在水稻免疫中的双重调控角色。在缺乏Piz-t的水稻中，OsTZF1通过激活下游防御基因（如OsSGT1和OsKS4）正调控基础免疫（PTI）。而在含有Piz-t的水稻中，OsTZF1直接结合Piz-t基因的特定区域，抑制其转录，从而负调控Piz-t介导的抗病性。敲除OsTZF1能够释放Piz-t的表达，使其在应对原本“兼容”（毒性）的稻瘟菌菌株时也能发挥更强的抗病作用，即拓宽了Piz-t的抗谱，且不牺牲水稻的农艺性状。这种通过精细调控免疫负调控因子来增强NLR受体抗病性的策略，为未来作物抗病育种提供了新思路。通过基因编辑等技术靶向类似OsTZF1的调控节点，有望实现“减负增效”，在维持作物高产的同时，赋予其持久、广谱的抗病能力，对于保障粮食安全具有重要意义。