高氨环境下甲烷球菌（Methanoculleus bourgensis）通过积累Nε-乙酰-β-赖氨酸（Nε-acetyl-β-lysine）增强氨耐受性的机制研究

《FEMS Microbiology Letters》：Nε-acetyl-β-lysine or glycine betaine as compatible solutes in response to increasing ammonia in Methanoculleus sp strains

本研究针对厌氧消化过程中高氨氮抑制甲烷生成的难题，系统探讨了来自高氨沼气池的Methanoculleus bourgensis菌株在氨胁迫下的渗透调节机制。通过HR-MAS NMR和LC-MS技术，首次发现该类菌株在氨胁迫下特异性积累Nε-乙酰-β-赖氨酸（而非常见的甘氨酸甜菜碱），揭示了其通过合成β-氨基酸衍生物适应高氨环境的新策略。该发现为解析氨耐受型产甲烷菌的生理适应性提供了关键分子证据，对优化沼气工艺的氨抑制调控具有重要指导意义。

　　

在追求可再生能源的时代，沼气技术通过厌氧消化（AD）将有机废弃物转化为甲烷，成为可持续发展的重要一环。然而，当处理富含蛋白质的废弃物（如餐厨垃圾和畜禽粪便）时，降解过程会释放大量铵离子（NH₄⁺），其在水中部分转化为游离氨（NH₃）。游离氨能自由穿透细胞膜，进入细胞后扰乱pH稳态并增加渗透压，导致细胞肿胀甚至裂解，尤其对乙酸利用型（aceticlastic）产甲烷菌产生强烈抑制，引起挥发性脂肪酸积累和甲烷产量下降。尽管已知产甲烷菌能通过积累兼容性溶质（compatible solutes）来抵抗渗透胁迫，但关于它们如何应对高氨环境的具体机制仍知之甚少。

在这项发表于《FEMS Microbiology Letters》的研究中，瑞典农业科学大学的Anna Schnürer团队将目光投向了经常在高氨沼气池中占主导地位的氢营养型产甲烷菌——Methanoculleus bourgensis。研究人员比较了从高氨环境中分离的四个M. bourgensis菌株（MAB1, MAB2, MAB3, BA1）与模式菌株M. bourgensis MS2^T（来自低氨环境）以及耐盐菌Methanoculleus submarinus Nankai-1^T在不同铵盐浓度下的耐受性和渗透调节策略。

为了揭示其适应机制，研究人员运用了几项关键技术：通过逐步提高培养基中的氯化铵浓度（0.1至25 g L^-1NH₄⁺-N）来评估菌株的氨耐受性和适应性；采用高分辨率魔角旋转核磁共振（HR-MAS NMR）对完整细胞进行无损分析，直接鉴定细胞内主要代谢物；利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）并结合氘代内标（甘氨酸甜菜碱-d₉和N^ε-乙酰-d₃-β-赖氨酸）对目标相容性溶质进行精确定量和鉴定；此外，还通过基因组信息分析验证了关键合成通路的存在。

氨耐受性评估

所有来自高氨沼气池的菌株（MAB1, MAB2, MAB3, BA1）在未经逐步适应时，甲烷产率在氨氮浓度超过8-10 g L^-1时开始下降，并在12 g L^-1时停止。然而，通过逐步适应，这些菌株的耐受性显著提高，在高达12 g L^-1NH₄⁺-N的条件下仍能维持初始甲烷产率，但均在25 g L^-1时完全抑制。相比之下，模式菌株MS2^T即使在逐步适应后，其甲烷产率在超过6 g L^-1NH₄⁺-N时即开始下降，并在12 g L^-1时停止。耐盐菌Nankai-1^T在0.1-15 g L^-1NH₄⁺-N范围内保持稳定的甲烷产率，但在18 g L^-1及以上浓度时无法产甲烷。这表明来自高氨环境的M. bourgensis菌株通过适应获得了显著优于其模式菌株的氨耐受性。

相容性溶质的鉴定

对在高氨（12 g L^-1NH₄⁺-N）条件下培养的M. bourgensis BA1进行HR-MAS NMR分析，其¹H-NMR谱图显示出两种主要低分子量代谢物的信号。通过二维NMR技术（COSY, TOCSY, HSQC, HMBC）以及LC-MS分析，这两种化合物被明确鉴定为甘氨酸甜菜碱（glycine betaine）和N^ε-乙酰-β-赖氨酸（N^ε-acetyl-β-lysine）。后续对全部菌株的LC-MS分析证实，所有来自高氨环境的M. bourgensis菌株（BA1, MAB1, MAB2, MAB3）在氨胁迫下均积累了N^ε-乙酰-β-赖氨酸，而模式菌株MS2^T中仅检测到甘氨酸甜菜碱。

甘氨酸甜菜碱和N^ε-乙酰-β-赖氨酸的定量分析

定量分析揭示了不同菌株渗透调节策略的显著差异。在12 g L^-1Na⁺胁迫下，所有菌株都大量积累甘氨酸甜菜碱（M. bourgensis MAB2: 5.1 μg mL^-1；M. submarinus Nankai-1^T: 3.9 μg mL^-1；M. bourgensis MS2^T: 6.3 μg mL^-1）。然而，在应对氨胁迫（12 g L^-1NH₄⁺-N）时，策略迥异：M. bourgensis MAB2选择性地大量积累N^ε-乙酰-β-赖氨酸（2.7 μg mL^-1），且其浓度随氨氮水平升高而增加，而甘氨酸甜菜碱含量始终很低。M. submarinus Nankai-1^T在氨胁迫下积累高水平的甘氨酸甜菜碱（2.5 μg mL^-1），但N^ε-乙酰-β-赖氨酸含量极低。M. bourgensis MS2^T在氨胁迫下甘氨酸甜菜碱积累量显著降低，且未检测到可量化的N^ε-乙酰-β-赖氨酸。

讨论与结论

本研究首次在纯培养条件下明确证实了M. bourgensis菌株在应对高氨胁迫时特异性积累N^ε-乙酰-β-赖氨酸的现象。这种β-氨基酸衍生物此前已知是古菌应对高盐（NaCl）胁迫的渗透保护剂，但其与高氨/铵水平的直接关联尚未被报道。这一发现为解释M. bourgensis为何能在高氨沼气池中占据优势提供了关键的生理机制。

值得注意的是，基因组分析显示，即使是不产生或低产N^ε-乙酰-β-赖氨酸的M. bourgensis MS2^T和M. submarinus Nankai-1^T，其基因组中也含有完整的生物合成通路基因（ablA, ablB）。这种“有基因无表达”的现象可能源于多种因素：MS2^T生长速率慢导致溶质积累量低；甘氨酸甜菜碱可能抑制了N^ε-乙酰-β-赖氨酸的合成（如在Methanosarcina中所示）；或者长期适应高氨环境是激活该合成通路的前提。来自高氨环境的菌株经过长期培养驯化，可能已经完成了这种生理适应。

该研究对厌氧消化过程具有重要启示。不同菌株渗透调节策略的差异性表明，通过投加特定相容性溶质（如甘氨酸甜菜碱、N^ε-乙酰-β-赖氨酸）或引入预适应的产甲烷菌进行生物强化，有望缓解氨抑制。已有研究表明，在氨胁迫下的厌氧消化系统中，Methanoculleus的ablB基因（编码N^ε-乙酰-β-赖氨酸合成酶）表达上调。因此，靶向添加N^ε-乙酰-β-赖氨酸或利用能合成该溶质的菌株进行生物强化，是未来值得探索的氨抑制缓解策略。

综上所述，本研究揭示了M. bourgensis通过合成N^ε-乙酰-β-赖氨酸这一独特机制来适应高氨环境，不仅增进了对产甲烷菌渗透适应生理的理解，也为优化高氨有机废物厌氧消化工艺提供了新的理论依据和潜在的技术路径。