抗体片段规模化生产新策略：基于大肠杆菌表达与自动化重折叠系统的结合

《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》：A strategy for scalable antibody production: the combination of Escherichia coli expression, translation-enhancing peptide and automated refolding system

本研究针对微生物系统生产抗体片段时包涵体形成与重折叠效率低的问题，开发了结合SKIK翻译增强肽、亮氨酸拉链标签与连续透析自动化重折叠的创新策略。结果表明，该方案在保持98%重折叠得率的同时，将处理时间缩短60%，化学品消耗降低53%，为工业化生产功能性Fab片段提供了资源高效的新型技术平台。

　　

在生物医学研究、诊断技术和治疗开发领域，单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）犹如一把精准的“分子钥匙”，发挥着不可替代的作用。然而，传统上用于生产这些抗体的哺乳动物细胞培养系统，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，虽然能产生完整的、经过糖基化修饰的抗体，但其过程往往伴随着高昂的成本、较长的生产周期以及复杂的设施要求。这在一定程度上限制了抗体的可及性和广泛应用。因此，科学家们一直在寻找更经济、更高效的替代生产方案。

其中，大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）作为一种模式微生物，因其生长快速、培养简单、成本低廉而备受青睐。它就像一个高效的“蛋白质工厂”。不过，这个工厂也有其局限性：它不适合生产需要复杂糖基化修饰的全长抗体。幸运的是，许多重要的抗体片段，如抗原结合片段（Fragment antigen-binding, Fab）和单链可变区片段（single-chain variable fragments, scFvs），其功能并不依赖于糖基化。因此，利用大肠杆菌来生产这些抗体片段成为了一个极具吸引力的方向。

然而，将大肠杆菌打造成高效的抗体片段工厂并非易事。一个核心挑战在于，当外源基因在这个“工厂”里被高速翻译成蛋白质时，蛋白质分子容易发生错误折叠、聚集，并最终形成不溶性的固体颗粒——包涵体（inclusion bodies, IBs）。这好比工厂生产线过快，生产出的零件来不及正确组装，堆成了一堆废料。虽然包涵体可以保护蛋白质不被降解，并能达到很高的产量，但其中的蛋白质失去了天然构象和生物活性。要获得有功能的蛋白质，就必须将这些“废料”进行溶解，然后通过一个称为“重折叠”（refolding）的精细过程，使其恢复正确的三维结构。传统的重折叠方法，如逐步稀释透析，虽然有效，但往往流程繁琐、耗时漫长、试剂消耗量大，且难以放大到工业生产规模。这些瓶颈严重制约了基于大肠杆菌的抗体片段生产技术的推广。

为了解决这些难题，由日本名古屋大学（Nagoya University）的Teruyo Ojima-Kato副教授领导的研究团队，在《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》期刊上发表了一项创新性研究。他们巧妙地将多种策略组合在一起，开发出一套从高效表达到大规模式重折叠的完整技术方案，旨在打通抗体片段低成本、规模化生产的“最后一公里”。

为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法：首先，他们利用分子克隆技术构建了表达载体，将模型抗体（抗E. coli O157 Fab）的基因与翻译增强肽SKIK和亮氨酸拉链（Leucine zipper, LZ）标签进行融合，并在大肠杆菌Nico21(DE3)菌株中通过自动诱导进行高水平表达，使目标蛋白主要以包涵体形式积累。其次，他们设计并搭建了一套基于连续透析的自动化重折叠装置，通过精确控制流加和排出速度，实现变性剂盐酸胍（GdnHCl）浓度的平稳线性降低。最后，他们综合运用蛋白电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹（Western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和生物层干涉技术（Bio-layer Interferometry, BLI）等多种分析手段，系统地评估了重折叠效率、蛋白纯度以及重构抗体的抗原结合活性和亲和力。

表达策略的成功验证

研究人员首先致力于提高抗体片段在大肠杆菌中的产量。他们采用了之前开发的“秘密武器”——SKIK肽标签。当这个短肽连接到目标蛋白的N端时，能像给翻译机器加了“加速器”一样，显著提升蛋白质的合成速度。正如预期，无论是共表达Fab的重链（Hc）和轻链（Lc），还是将它们分开表达，融合了SKIK标签的蛋白都成功地在菌体内大量积累，并主要形成了包涵体（图1b）。这表明他们的第一步策略——利用包涵体作为高产量存储单元——取得了成功。同时，他们还测试了另一种策略，即给Fab的Hc和Lc分别融合上能特异性地相互配对、避免错配的亮氨酸拉链（LZ）标签，形成FabLZ格式，以期在后续重折叠中促进正确链间配对。

自动化重折叠与常规方法的首次较量

既然目标蛋白已经高效地“囤积”在了包涵体中，接下来最关键也是最富挑战性的步骤就是如何将它们高效地“复活”——即重折叠。研究团队的核心创新点在于开发了一套自动化重折叠系统（图2）。该系统通过一个双向蠕动泵，连续地将新鲜透析缓冲液输入透析外室，并同时排出等量的旧缓冲液，从而实现对变性剂GdnHCl浓度的平稳、连续稀释，替代了传统方法中耗时费力的多次手动缓冲液更换。

为了检验新方法的有效性，他们首先将自动化重折叠（总过程约24小时）与经过改良的常规逐步重折叠方法（总过程约60小时）进行了正面比较。结果显示（图1c），通过自动化方法重折叠得到的FabLZ，其抗原结合活性甚至略高于逐步方法得到的产物。这表明，新开发的自动化系统不仅能够工作，而且效果不逊于甚至优于传统方法，为后续优化和应用打下了坚实基础。同时，数据也证实，带有LZ标签的FabLZ格式在任何重折叠方法下都表现出比普通Fab格式更高的活性，凸显了LZ标签在促进正确链配对方面的优势。

优化表达模式与重折叠时间

在确认了自动化重折叠的可行性后，研究人员开始着手优化整个流程。他们比较了共表达（Hc和Lc由同一个质粒表达）与分开表达（Hc和Lc由两个质粒分别表达）对重折叠效果的影响。结果发现（图1d, e），共表达模式产生的包涵体，在经过重折叠后，其得率和功能性均优于分开表达的模式。这可能是因为在共表达时，Hc和Lc在同一个包涵体颗粒内紧密靠近，更利于它们在重折叠过程中找到“正确伴侣”，从而高效形成有活性的异二聚体。因此，后续研究均采用共表达模式。

重折叠过程犹如一个精细的“慢火炖汤”，时间把控至关重要。太快了，蛋白质来不及正确折叠就会聚集；太慢了，又可能增加副反应的风险。研究人员测试了12小时到30小时不等的总重折叠时间（图3a）。结果表明（图3b, c），24小时的条件为Fab和FabLZ都带来了最高的重折叠得率和抗原结合活性。12小时过程太短，导致折叠不完全；而30小时过程过长，过长时间暴露于氧化还原环境可能引起二硫键的“错配”（二硫键 shuffling）。这一优化确定了自动化重折叠的最佳“火候”。

深度纯化与功能验证

为了获得高纯度的样品并进行严格的功能比较，研究人员对通过最佳条件（24小时自动化重折叠和60小时逐步重折叠）得到的产物进行了多步纯化，包括 immobilized metal affinity chromatography (IMAC，固定化金属亲和层析) 和 size-exclusion chromatography (SEC，尺寸排阻色谱)（图4a, b）。纯化后的产率统计显示（表1），自动化方法最终获得的总活性蛋白得率（FabLZ为21%）高于逐步方法（14%）。更重要的是，ELISA分析证实（图4c），纯化后的抗体片段保持了高水平的抗原结合活性。

最后，利用生物层干涉技术（BLI）对纯化蛋白进行的动力学分析显示（图5），无论是通过自动化方法还是逐步方法重折叠获得的FabLZ和Fab，它们与抗原（E. coli O157）的结合亲和力（以平衡解离常数K_D表示）均处于纳摩尔（nM）水平，且两者之间没有显著差异。这表明自动化重折叠过程并没有牺牲产品的质量，能够生产出与经典方法相媲美的高功能性抗体片段。

结论与重要意义

本研究成功地建立了一套整合性的高效抗体片段生产平台。该平台的核心优势在于：首先，利用SKIK翻译增强肽实现了抗体片段在大肠杆菌包涵体中的高产；其次，通过亮氨酸拉链（LZ）标签促进了重折叠过程中重链与轻链的正确配对；最关键的是，开发了一套简单、可靠的自动化连续透析重折叠系统。

与传统的逐步重折叠方法相比，该自动化系统展现出了巨大的工艺优势（表2）：它将总处理时间从60小时缩短至24小时（减少60%），所产生的废液体积降低了31%，变性剂GdnHCl的消耗量降低了53%。这意味着该技术不仅在效率上更高，而且在成本和环境友好性方面也更具优势。

这项研究的成功，为在大肠杆菌系统中进行功能性抗体片段的规模化生产提供了一条切实可行、且易于放大的新路径。它巧妙地绕过了哺乳动物细胞培养的高成本和复杂性，同时又通过创新的工艺设计克服了微生物表达中重折叠的瓶颈。这项技术有望在生物制药、诊断试剂开发以及基础研究等领域获得广泛应用，为更多高效、低成本的生物药问世铺平道路。