通过谷氨酰胺响应通路实现碳-氮协同作用，可在渗透压胁迫下增强大肠杆菌中的氨基酸生成

《Bioresource Technology》：Carbon–nitrogen coordination via glutamine-responsive circuits enhances amino acid production in Escherichia coli under osmotic stress

本研究发现大肠杆菌发酵后期氨基酸积累引发渗透压胁迫，导致氮代谢关键中间体谷氨酰胺和谷氨酸池耗竭，从而限制赖氨酸和精氨酸合成。通过构建温度敏感型谷氨酰胺响应双向调控系统（TGRBRs），有效提升这两类氨基酸的产量分别达到120.68 g/L和185.52 g/L，验证了动态氮代谢调控对突破碳氮平衡瓶颈的关键作用。

　　

王明|何胜阳|王浩淼|梁光杰|高聪|刘佳|李晓敏|胡桂鹏|吴静|刘立明

江南大学生物技术学院及教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡214122

摘要

大肠杆菌是研究氨基酸生物合成中碳氮调控的关键模式生物，但大多数研究都集中在碳代谢上，导致氮代谢的研究不足，从而限制了生产潜力。本研究发现，由氨基酸积累引起的渗透压胁迫会损害发酵后期的铵吸收，导致细胞内l-谷氨酸和l-谷氨酰胺的储备显著减少，进而影响l-精氨酸和l-赖氨酸的合成。为克服这一限制，研究人员开发了一种对l-谷氨酰胺敏感的双向调控系统（ONGNRs），以感知细胞内的l-谷氨酰胺水平并调节铵的吸收。该系统有效增加了细胞内l-谷氨酸和l-谷氨酰胺的储备，使l-精氨酸的产量达到120.68克/升（最高产量，0.55克/克）。进一步优化后，l-赖氨酸的产量也提升至185.52克/升（最高产量，0.77克/克）。我们的研究结果强调了碳氮协同作用在高效氨基酸生物合成中的重要性，并为改进工业菌株提供了机制框架。

引言

大肠杆菌因其易于培养、遗传特性明确、具备先进的基因编辑工具以及良好的工业适用性，长期以来一直被用作氨基酸生产的平台（Zhao等人，2025年）。研究人员采用了多种策略来提高前体物质和辅因子的供应，包括解除反馈抑制、消除副产物途径、改进运输系统以及优化核心碳代谢（Shimizu和Matsuoka，2022年）。此外，基于CRISPR的编辑技术和能够响应代谢物或环境信号的生物传感器动态电路也使得通量控制更加精确，显著提高了产物的产量（Ding等人，2025年；Liu等人，2022年；Tang等人，2024年）。利用这些方法，l-赖氨酸（Ye等人，2020年）、l-苏氨酸（Jin等人，2025年）、l-精氨酸（Jiang等人，2023年）、l-酪氨酸（Chen等人，2025b年）和l-丙氨酸（Li等人，2025a年）在大肠杆菌中的产量均超过了100克/升。尽管取得了这些进展，但大多数研究仍集中在碳代谢上。氨基酸作为含氮化合物，需要碳骨架和氮原子，且两者之间的需求差异显著（Jiang等人，2021年）。例如，l-精氨酸的N/C比为4:6，l-组氨酸为3:6，而l-苯丙氨酸和l-酪氨酸仅为1:9，因此在生物合成过程中需要不同的氮流。因此，氮代谢对于维持生长、保持碳氮平衡以及高效合成氨基酸至关重要（Rehm和Burkovski，2011年）。因此，精确调控氮流对于实现高水平的氨基酸生产至关重要。

工业菌株在氨基酸生物合成过程中既利用有机氮源也利用无机氮源。在大肠杆菌中，铵盐是首选的氮源，尽管小肽和细胞外氨基酸也能被吸收（Luque-Almagro等人，2011年；Szopa等人，2023年；Zhang等人，2025年）。铵主要通过谷氨酰胺合成酶GlnA/谷氨酸合成酶GltBD（GS/GOGAT）循环和谷氨酸脱氢酶（GDH）途径（涉及GdhA）被吸收，这些途径将NH₃和α-酮戊二酸转化为l-谷氨酸和l-谷氨酰胺。这些代谢物是氨基酸和核苷酸生物合成中的通用前体和主要氮供体（van Heeswijk等人，2013年）。铵的吸收受到多级调控，包括在氮限制条件下由NtrB/NtrC系统进行的转录调控、GlnB/GlnK和GlnE对GlnA的翻译后修饰、在PII控制下由AmtB进行的铵吸收，以及Nac和PTS^Ntr等调节因子对整体碳氮平衡的协调（van Heeswijk等人，2013年）。这些网络使得大肠杆菌能够动态调节氮的吸收和利用，以及碳氮通量的分配（van Heeswijk等人，2013年）。工程策略可以增强吸收途径（Guo等人，2017年）、修改酶活性（Liu等人，2021年；Xu等人，2019年）并提高铵的吸收能力（Sindelar和Wendisch，2007年）。例如，共表达glnA和aspA可以增加细胞内l-谷氨酰胺和l-天冬氨酸的储备，使l-精氨酸的产量增加41.5%（Guo等人，2017年）；删除调节因子amtR可以提高吸收酶的活性，使l-赖氨酸和l-精氨酸的产量分别增加8.5%和16.7%（Liu等人，2021年；Xu等人，2019年）；过表达amtB或amtA可以进一步增强氮的吸收并提高氨基酸产量（Sindelar和Wendisch，2007年；Xu等人，2019年）。然而，静态调控无法适应细胞内氮状态的波动，这可能导致碳氮失衡、l-谷氨酸/l-谷氨酰胺的过度积累以及产量下降（Guo等人，2017年）。这些局限性表明，实现高效氨基酸生产需要实时动态调控氮流（表1）。

在本研究中，我们探讨了大肠杆菌的氮代谢机制，并开发了一种对l-谷氨酰胺敏感的热敏双向调控系统（TGRBRs），以实现氮流的动态调节，从而提高氨基酸产量。这种动态调控策略显著增强了氨基酸的生产，为优化微生物细胞工厂提供了一种通用方法。

菌株、质粒和基因

本研究使用的所有菌株和质粒的详细信息见补充材料。本研究使用的异源基因序列（如BsglnA、BsglnA和cI⁸⁵⁷）也列在补充材料中。大肠杆菌 JM109被用作质粒构建的宿主菌株。传感器荧光特性分析使用的是大肠杆菌 MG1655。大肠杆菌 ARG3和LYS1分别被选为l-精氨酸和l-赖氨酸生产的宿主菌株。使用的质粒包括pTargetF和pCas9（CRISPR-Cas9）

铵吸收减少限制了l-精氨酸的生物合成

产精氨酸的大肠杆菌菌株ARG3的构建过程如下：(1) 菌株ARG0源自大肠杆菌 MG1655，携带四个关键突变：argA^K204T、argR^Y33X、pyrG^D450H和speB^E189A。(2) 通过删除speC和speF并将Thermotoga neapolitana中的argJ基因整合到argE位点，将ARG1进行改造。(3> 之后，通过将argCBH、argA^K204T、argD、argI和argG整合到yghX、yncI和ycjV中，并引入lysE和cgmA，开发出了ARG2

结论

本研究发现，发酵液中氨基酸积累引起的渗透压胁迫会损害大肠杆菌的氮吸收。铵吸收受阻会导致细胞内l-谷氨酸和l-谷氨酰胺的储备减少，进而影响依赖这些代谢物作为前体或氮供体的l-精氨酸和l-赖氨酸的产量。为克服这一限制，我们开发了TGRBRs系统，以在高渗透压胁迫下调节铵的吸收，显著提高了产量

CRediT作者贡献声明

王明： 何胜阳： 王浩淼： 梁光杰： 高聪： 刘佳： 李晓敏： 胡桂鹏： 吴静： 刘立明： 负责撰写、审稿和编辑工作；负责资金筹集。

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