培育基因稳定的大肠杆菌以实现有效的肌醇生产

《Bioresource Technology》：Establishing genetically stable Escherichia coli for effective myo-inositol production

本研究构建了一种通过组合诱导型和组成型启动子的多拷贝整合大肠杆菌工程菌株，优化碳运输效率和氮源供应，实现肌醇高效生产，在3L生物反应器中达到191.72g/L产量，碳产率0.70g/g，生产率1.59g/L/h，显著提升工业应用潜力。

　　

Jiu Dai|Ke Jiang|Yong Du|Shunmin Ji|Xiaolin Shen|Jia Wang|Xinxiao Sun|Qipeng Yuan

北京化工大学化学资源工程国家重点实验室，中国北京市北三环东路15号，100029

摘要

肌醇（MI），也称为维生素B8，参与多种生理过程，如血糖调节、脂质代谢和细胞衰老。 大肠杆菌已成为MI生物合成的有前景的微生物底盘。然而，其工业应用往往受到高表达系统中代谢负担和遗传不稳定性的限制。在这项研究中，我们采用了诱导型和组成型启动子的组合来表达INO1和suhB基因，从而构建了一个多拷贝整合菌株。随后，通过代谢工程策略提高碳运输效率和优化氮源供应，进一步缩短了发酵时间。在优化的分批发酵条件下，最终工程菌株实现了191.72?g/L的MI浓度、0.70?g/g的碳产率和1.59?g/L/h的生产率。本研究提出了一种有效的策略，用于开发适合高价值生化物质工业生产的稳定高效微生物细胞工厂。

引言

肌醇（MI）是九种肌醇异构体之一，广泛存在于各种生物体内，在细胞过程中起着关键作用，例如磷脂衍生的信号转导。它还参与内分泌调节、能量代谢和细胞抗衰老机制，因此在食品、农业、医疗保健和化妆品行业中有广泛的应用（Li等人，2022年）。此外，MI还是葡萄糖醛酸（Doong等人，2018年）、岩藻-肌醇（Ramp等人，2021年）和d-手性-肌醇（Ji等人，2024年；Ramp等人，2023年）的前体，随着市场需求的增长，预计到2030年该行业规模将达到17亿元人民币。

在工业实践中，MI通常通过植酸水解生产。然而，这种方法成本高、反应条件苛刻且存在环境问题（Mann，1954年）。因此，绿色生物合成作为一种可持续且高效的MI生产方法应运而生。MI通过由肌醇磷酸合酶（IPS）和肌醇单磷酸酶（IMP）依次催化的两步途径从葡萄糖-6-磷酸（G6P）合成。体外酶转化提供了一种有效的途径，具有高产率、快速动力学和操作灵活性（Rollin等人，2015年；Zhu等人，2014年）。例如，You等人筛选了关键酶，并建立了一个体外系统，在2000升生物反应器中于70?°C下从淀粉中生产出95?g/L的MI，无需补充ATP或NADP⁺（You等人，2017年）。在另一项研究中，Zhong等人从蔗糖中合成了MI，最终产率为0.98?mol/mol（Zhong等人，2017年）。同样，Wang等人使用三种新型耐热酶开发了一种三酶级联反应，以葡萄糖为底物，生产出110.8?g/L的肌醇，转化率为92.3%（Wang等人，2022年）。尽管取得了这些进展，体外酶转化的工业竞争力仍受到酶重复使用性低等挑战的限制。

随着系统代谢工程的进步，构建用于高价值化合物合成的高效微生物细胞工厂已成为主导趋势（Nielsen和Keasling，2016年；Pickens等人，2011年）。高产MI生产的主要挑战是与中心代谢对碳流的竞争。目前的策略包括阻断竞争途径、实施动态调控和共利用双重碳源。例如，通过阻断G6P的竞争途径（如EMP、PPP和肌醇氧化），在Kluyveromyces marxianus中生产出了80.7?g/L的MI（Lan等人，2025年）。在Pichia pastoris中，通过对糖酵解基因的动态调控，将代谢从生长转向生产，在10升生物反应器中实现了30.71?g/L的MI浓度（Zhang等人，2022年）。You等人将Trypanosoma brucei中的INO1基因引入E. coli并敲除了碳代谢基因（如pgi、zwf），从而重新分配了碳源，使MI浓度提高到106.3?g/L，葡萄糖产率为0.82?mol/mol（You等人，2020年）。在之前的研究中，我们开发了一种协同碳利用机制（SynCar）用于MI生物合成（Tang等人，2020年）。通过阻断葡萄糖消耗（通过删除pgi和zwf），碳流被重新导向MI合成。甘油作为次要碳源，与通过磷酸转移酶系统（PTS）的葡萄糖吸收相结合，将细胞生长与MI生产联系起来，实现了76?g/L的浓度和0.68?g/g的总碳产率。

在使用基于质粒的系统进行工业生产时，质粒在连续几代中的丢失以及大量或多个基因带来的代谢负担常常会损害稳定性和可控性（Carroll & Wong，2018年）。这种不稳定性可能导致产量波动并限制细胞生长（Guo等人，2024年；Silva等人，2012年），从而限制了工业潜力和经济可行性。在这项研究中，我们开发了一种遗传稳定的工程菌株，用于高效MI生物合成（图1）。首先，我们通过双启动子盒整合系统设计了一个集成生产模块，结合了诱导型和组成型启动子来驱动INO1和suhB基因的表达。该模块被多个拷贝整合到E. coli的基因组中，显著增强了途径表达。随后，我们通过增加细胞内碳和氮的可用性来提高肌醇合成效率，实现了完全的葡萄糖转化，同时减少了发酵时间和碳消耗。最后，优化了培养基组成，以改善大规模发酵条件。该平台在3升生物反应器中实现了191.72?g/L的MI浓度和0.70?g/g的总碳产率。

部分摘录

培养基和菌株

Luria‐Bertani（LB）培养基用于质粒扩增和种子培养。M9Y培养基用于MI生产。LB培养基含有10?g/L色氨酸、5?g/L酵母提取物和10?g/L NaCl。M9Y培养基含有6.78?g/L Na₂HPO₄、3?g/L KH₂PO₄、0.5?g/L NaCl、1?g/L (NH₄)₂SO₄、1?mM MgSO₄、0.1?mM CaCl₂、2?g/L酵母提取物、5?g/L甘油，根据需要可增加至10?g/L甘油和20?g/L葡萄糖。E. coli DH5α用于质粒扩增和保存。

诱导型和组成型启动子的组合使用用于途径整合

在MI生物合成途径中，S. cerevisiae中的INO1（编码IPS）和E. coli中的内源性suhB（编码IMP）是关键酶，分别催化G6P向I1P和I1P向MI的顺序转化。在之前的研究中，这两个基因在多拷贝质粒上共表达。然而，在传代培养过程中经常观察到质粒丢失和遗传不稳定。为了解决这些与基于质粒的表达系统相关的问题，我们构建了一个稳定的

结论

本研究开发了一种工程化的E. coli菌株，其基因组中整合了合成途径，并通过双启动子系统进行调控，以实现高效MI生产，从而提高了其工业应用性。通过结合使用诱导型和组成型启动子来驱动关键途径基因INO1和suhB的表达，我们构建了一个稳健的基因组整合表达模块，确保了基因表达的平衡。逐步多拷贝整合操纵子使得MI生产更加高效

CRediT作者贡献声明

Jiu Dai：撰写——原始草稿、软件、资源、方法论、研究、数据分析。Ke Jiang：撰写——原始草稿、软件、资源、研究。Yong Du：资源、数据分析。Shunmin Ji：资源、数据分析。Xiaolin Shen：撰写——原始草稿、监督。Jia Wang：撰写——原始草稿、监督。Xinxiao Sun：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、软件、资源、资金获取、数据分析。Qipeng Yuan：撰写

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