通过定量评估独立 yet 协同的活性来确定人类 RNA 加帽甲基转移酶的底物特异性

《Protein Science》：Defining substrate specificities of human RNA capping methyltransferases through quantitative assessment of independent yet cooperative activities

RNA甲基转移酶的底物特异性与协同作用研究。通过放射测定的系统评估和质谱验证，发现人类RNMT、CMTR1、CMTR2及新冠病毒nsp14、nsp16独立催化N7-鸟苷酸和2'-O-ribose甲基化，且CMTR1的甲基化增强RNMT活性。该成果为抗病毒和抗癌药物开发提供新靶点。

　　
人类RNA甲基转移酶（RNMT、CMTR1、CMTR2）与新冠病毒的nsp14和nsp10-nsp16复合体在RNA甲基化过程中的作用机制存在显著差异。本研究通过设计五种具有不同甲基化模式的RNA底物，结合放射性测法和质谱分析，系统评估了这些酶的底物特异性、动力学参数及协同作用，揭示了RNA甲基化过程中酶间动态互作的新模式。

RNA甲基化是真核生物mRNA成熟的关键步骤，涉及三个关键甲基化位点：N7-鸟苷（cap-0）、2'-羟基核糖（A）的2'-O-甲基（cap-1）和第二个核苷酸（C）的2'-O-甲基（cap-2）。人类通过RNMT、CMTR1、CMTR2分别完成这三个步骤，而新冠病毒则依赖nsp14和nsp10-nsp16复合体完成类似过程。然而，两者在甲基化顺序和酶间协作机制上存在本质区别。

实验首先构建了五种特异性RNA底物（GpppAC、mGpppAC、GpppAmC、mGpppACm、mGpppAmC），其中mGpppAC和mGpppACm分别包含N7-甲基鸟苷和2'-O-甲基腺苷基团。通过优化酶活性检测体系，研究发现：
1. **底物特异性明确性**：RNMT和nsp14仅催化N7-鸟苷甲基化，对其他位置无活性；CMTR1和nsp10-nsp16复合体特异性修饰2'-O-腺苷基团；CMTR2则专一修饰2'-O-胞苷基团。质谱验证显示所有酶仅产生单甲基化产物，证实其严格的位置特异性。
2. **协同作用模式差异**：
- 人类酶存在非顺序性协作：CMTR1对2'-O-甲基腺苷的修饰显著提升RNMT的N7-甲基化效率（kcat值提升7.6倍），表明甲基化位点的顺序可能影响后续酶活性。这种协同效应可能通过空间位阻或静电互补实现，如CMTR1修饰的2'-O-甲基基团与RNMT结合界面形成氢键网络。
- 病毒酶严格顺序依赖：nsp14必须先完成N7-甲基化，才能激活nsp10-nsp16复合体进行2'-O-甲基化，这种顺序性在质谱分离中表现为甲基化产物与底物的保留时间差异（RT）。
3. **动力学参数量化**：通过适配非典型S形曲线模型（替代传统米氏方程），获得各酶的K1/2和kcat值。例如，CMTR1对GpppAC的Km为56.2 nM，kcat为10.2 h?1；而CMTR2在mGpppAmC底物下的kcat达到3.4 h?1，显示其更高的催化效率。值得注意的是，nsp16在未甲基化底物（GpppAC）中完全无活性，但在存在N7-甲基化的mGpppAC中活性显著提升，说明其甲基化顺序依赖性。

结构生物学研究揭示了这种差异的分子基础。人类RNMT和nsp14的晶体结构显示，其催化界面被设计成仅容纳Gppp骨架，N7-甲基基团通过疏水相互作用稳定SAM结合位点的构象。相比之下，nsp10-nsp16复合体的结构显示其依赖N7-甲基化形成的氢键网络（C6823与mN7-G的甲基C原子间距3.6 ?）和疏水口袋（D6873的旋转构象）实现底物识别。CMTR1与CMTR2的α折叠结构显示，CMTR1的WW结构域直接与RNA转录起始区结合，而CMTR2的甲基转移酶结构域（M domain）在晶体模型中与mN7-G形成四氢吡咯啉相互作用，这种结构差异导致两者对底物修饰顺序的依赖性不同。

在应用层面，研究发现CMTR1的活性不受N7-甲基化的影响，而nsp16的甲基化活性高度依赖N7-甲基化。这种差异可能为抗病毒治疗提供新靶点：针对nsp14的抑制剂（如SAM类似物）可能阻断病毒RNA帽形成，而针对CMTR1的抑制剂可能同时影响病毒和宿主RNA甲基化。值得注意的是，CMTR2在未甲基化N7-G的底物（GpppAmC）中仍保持活性，提示其可能通过其他机制（如RNA二级结构诱导）补偿前序甲基化不足。

该研究还揭示了细胞内RNA甲基化动态调控的新机制。例如，CMTR1对2'-O-腺苷的修饰可能通过改变RNA二级结构（如形成假核苷酸对），增强RNMT的底物结合能力。质谱分析显示，甲基化产物与未修饰底物在保留时间上的差异（图6），其中RNMT甲基化产物（mGpppAC）比未修饰底物（GpppAC）更极性，而CMTR1产物（mGpppACm）因2'-O-甲基的疏水性导致极性降低，这种差异解释了质谱分离现象。

关于癌症治疗的应用，研究指出RNMT和CMTR1在胚胎干细胞分化中存在负向调控。当CMTR1过度表达导致2'-O-甲基化增强时，可能通过形成甲基化保护层抑制RNMT活性，从而调控ES细胞向特定分化方向。质谱验证发现，在mGpppACm底物中，CMTR1的甲基化效率比GpppAC提高2.3倍，而RNMT的kcat值同步提升，这种协同效应在质谱峰强度中得到验证（图5）。

病毒学方面，nsp14的甲基化活性在存在2'-O-甲基时提升3倍（表2），但质谱显示其产物仍为单一N7-甲基化产物，表明nsp14不具备后续甲基化能力。这与人类CMTR1和CMTR2的顺序性不同，病毒酶更依赖严格顺序的底物供应。这种差异可能解释了为什么抗病毒药物靶向nsp14后仍需考虑宿主RNA甲基化的干扰效应。

总之，本研究通过系统动力学分析和结构生物学证据，明确了RNA甲基化酶的非重叠功能域和动态协作机制。人类酶的并行性和协同性使其在细胞稳态调控中具有更高灵活性，而病毒酶的顺序性依赖性可能成为抗病毒药物设计的关键靶点。这些发现为开发基于RNA甲基化通路的新型抗癌和抗病毒疗法提供了理论依据，特别是在靶向CMTR1-RNMT协同系统或nsp14-nsp16顺序复合体方面具有潜在应用价值。