《npj Regenerative Medicine》：Long-term evaluation of human iPSC-derived cartilage for repairing chondral defects
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本研究针对软骨自我修复能力有限、现有细胞疗法易发生肥大化转化等问题，系统评估了人诱导多能干细胞（iPSC）来源软骨在修复大鼠软骨缺损中的长期（48周）效果。结果表明，iPSC来源软骨较间充质干细胞（MSC）来源软骨表现出更低的肥大化（COL10A1降低5倍）和凋亡水平，并能更好地维持透明软骨表型，且未引起周围宿主软骨降解。该研究为iPSC在软骨再生领域的长期安全应用提供了关键证据。
关节软骨一旦损伤便极难自我修复，这为全球数百万骨关节炎患者带来了长期痛苦。目前临床上常用的自体软骨细胞移植（ACI）技术面临供体组织有限、细胞去分化等问题。而间充质干细胞（MSC）虽然来源广泛，但在软骨分化过程中易发生肥大化转化，导致组织纤维化、骨化和细胞凋亡，长期效果不尽如人意。
近年来，诱导多能干细胞（iPSC）技术的出现为软骨再生带来了新希望。这种通过重编程体细胞获得的干细胞具有无限增殖和多向分化潜能，理论上可以提供无限的软骨细胞来源。然而，一个关键问题尚未得到充分解答：iPSC来源的软骨能否在体内长期保持稳定？患者期望移植的软骨组织能够维持数十年，但此前最长的动物研究仅持续了6个月。
为了解决这一关键问题，由Yangfan Lu、Elizabeth R. Kats、Sophie E. Hines等研究人员组成的团队在《npj Regenerative Medicine》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了一项为期48周（相当于人类30年）的长期研究，系统比较了人iPSC来源软骨与MSC来源软骨在修复大鼠软骨缺损中的表现。
研究人员首先优化了培养条件，发现BMP4与TGFβ3联合使用能最有效地促进iPSC来源多能祖细胞（iMPC）的软骨形成。随后，他们进行了长达56天的体外软骨形成实验，并监测了软骨形成和肥大化相关基因的表达变化。在动物实验中，研究人员将经过56天体外分化形成的软骨组织植入大鼠膝关节的软骨缺损处，分别在12周和48周后评估修复效果。
关键技术方法包括：从人骨髓中分离MSC并通过特定培养基诱导iMPC生成；进行 pellet 培养系统开展软骨形成实验；使用qRT-PCR、Western blot、组织化学染色和免疫组化分析软骨表型；通过RNA测序比较转录组差异；在大鼠 osteochondral 缺损模型中评估软骨修复效果；采用压力应用测量（PAM）设备进行膝关节痛觉过敏评估。
Cartilage generated by iPSCs displays lower hypertrophy levels than that from MSCs
研究人员通过长期体外软骨形成实验发现，iMPC来源软骨与MSC来源软骨在基因表达谱上存在显著差异。具体而言，软骨形成标志物COL2A1和ACAN在iMPC组中的表达持续上升至56天达到峰值，而在MSC组中则在28天达到峰值后开始下降。更重要的是，肥大化相关标志物COL10A1和BGLAP在MSC组中的表达水平显著高于iMPC组，其中COL10A1在56天时相差5倍。Western blot结果进一步证实，iMPC来源软骨的Runx2蛋白表达水平始终低于MSC组。组织学分析显示，iMPC来源软骨产生极少量的X型胶原（COL10），表现出低肥大化表型。
Cartilage generated by iPSCs displays lower apoptosis levels than that from MSCs
肥大化与细胞凋亡密切相关。研究人员发现，抗凋亡基因BCL2在iMPC组中的表达水平较低，而凋亡相关基因CASP3和CASP8的表达模式也存在组间差异。Western blot分析显示，MSC组组织表现出更高的BCL2和caspase-3水平。TUNEL染色结果最为明显：培养56天后，MSC来源软骨含有大量凋亡细胞，而iMPC来源软骨中仅有极少数细胞发生凋亡。
Cartilage generated by iPSCs generates fewer histocompatibility complex proteins and cytokines than that from MSCs
RNA测序分析揭示了两种软骨组织的转录组差异。主成分分析（PCA）将MSC和iMPC来源的软骨细胞分为两个明显不同的簇，表明它们在基因组水平上存在本质区别。基因本体（GO）分析显示，MSC来源软骨细胞中主要组织相容性复合体（MHC）蛋白、胶原降解、细胞因子产生和炎症相关通路显著富集。KEGG通路分析进一步表明，cGMP-PKG、MAPK、Notch、PI3K-Akt、Ras、JAK-STAT和Wnt通路是两组间差异最显著的信号通路。
Cartilage implants generated by iPSCs maintain a hyaline phenotype without negatively impacting native tissues
动物实验结果显示，在植入12周后，iMPC组已表现出更好的软骨形成，具有更多的II型胶原（COL2）和糖胺聚糖（GAGs）沉积，而MSC组则表现出更高水平的I型胶原（COL1）和骨钙素（OCN），提示更大的纤维化和肥大化。到48周时，差异更加明显：iMPC组缺损面积从约800μm减小到约600μm，而MSC组则从约1100μm扩大到约1600μm。更重要的是，MSC组部分大鼠的原生软骨出现严重降解，而iMPC组未观察到这一现象。疼痛评估也显示MSC组动物表现出更多疼痛行为。
研究结论表明，iPSC来源软骨在长期修复软骨缺损方面优于MSC来源软骨。经过48周（相当于人类30年）的观察，iMPC来源软骨不仅能更好地维持透明软骨表型，而且不会引起周围宿主软骨的降解。这一发现对未来的临床应用具有重要意义，因为患者期望软骨修复效果能够长期维持。
讨论部分指出，iPSC来源软骨表现出更低肥大化水平的机制可能与其较低的Runx2表达有关，而TGFβ信号通路在维持软骨细胞表型中可能发挥关键作用。安全性方面，研究中未发现肿瘤形成，但作者强调仍需对更多iPSC系和更长时间进行进一步评估。特别值得注意的是，MSC组出现的原生软骨降解现象此前未被报道，可能是由于MSC来源组织产生更多的促炎细胞因子或基质降解酶（如MMPs）所致。
该研究首次系统评估了iPSC来源软骨在免疫健全动物模型中的长期表现，为iPSC技术在软骨再生领域的临床应用提供了重要安全性和有效性数据。研究结果支持iPSC作为安全有效的细胞来源，用于长期软骨修复，为开发新一代软骨再生疗法奠定了坚实基础。
