利用嗜热梭菌（Clostridium thermocellum）从纤维素中生产2,3-丁二醇

《Metabolic Engineering Communications》：Engineering Clostridium thermocellum for production of 2,3-butanediol from cellulose

本研究通过工程化 Clostridium thermocellum 并利用细胞外系统生物学方法，识别了其23BD生物合成途径的限制步骤，发现外源BDH酶活性至关重要，同时通过补充醋酸改善红氧化平衡，使23BD产量达到19.7 mM，代谢产率为24%。该成果为开发高效23BD生物合成平台奠定基础。

　　
该研究致力于通过代谢工程改造产丁二醇的微生物载体，以提升纤维素转化为2,3-丁二醇（23BD）的效率和产量。具体而言，研究团队以Clostridium thermocellum（现更名为Acetivibrio thermocellus）为宿主，整合来自Bacillus licheniformis的alsD（乙酰乳酸合酶）、gdh（丁二醇脱氢酶）和budC（丁二醇脱氢酶）基因，构建完整的23BD合成途径。通过多组学分析和细胞外系统生物学方法，揭示了该途径的瓶颈环节，并提出了优化策略。

研究首先确认了C. thermocellum天然代谢途径的局限性。该菌株虽具备纤维素分解能力，但天然产物合成能力受限。作者通过异源表达B. licheniformis的alsD、gdh和budC基因，成功在C. thermocellum中重构了23BD合成途径。实验表明，整合alsD和gdh基因的菌株（AG9463）在5 g/L纤维素培养基中实现了19.7 mM的23BD产量，代谢产率达到24%。这一成果较天然产量的0.42 g/L有显著提升。

在酶活性分析方面，研究发现C. thermocellum虽含有als和aldc的潜在活性基因（如Clo1313_0099和Clo1313_0305），但其aldc活性天然受限。通过细胞外系统生物学方法，作者验证了BDH（丁二醇脱氢酶）的必要性，发现添加外源BDH能显著提升23BD产量。值得注意的是，该菌株自身并不产生BDH活性，这成为限制23BD合成的关键因素。

红氧化还原平衡的调控是研究的重要突破。传统糖代谢产生两分子NADH，而23BD合成仅消耗一分子NADH，导致电子冗余。通过引入外源发酵酶（如FDH）和优化碳源浓度，作者发现添加醋酸可有效缓解氧化还原压力。实验显示，在20 g/L纤维素培养基中添加10-20 g/L醋酸，可使23BD产量提升至13 mM，代谢产率优化至27%。

代谢流分析揭示了关键瓶颈：乙酰乳酸合成酶（ALS）和脱羧酶（ALDC）的活性虽存在，但受限于底物供应和中间产物积累。通过细胞外酶补充实验证实，alsD和aldc的活性并非主要制约因素，而是BDH的缺失导致电子传递链失衡。研究还发现，工程菌株AG9463在纤维素转化过程中表现出显著的代谢重编程：乳酸产量较亲本降低10倍，乙酸盐消耗量增加，表明23BD合成有效分流了代谢中间体。

在工程菌株构建方面，研究团队采用tSAGE（重组酶辅助基因组工程）技术，通过多步同源重组将目标基因整合到染色体中。通过比较不同RBS（核糖体结合位点）和终止子组合，发现使用P_Ct1194强启动子配合人工RBS（aggagga）可提升基因表达效率30%以上。此外，利用质谱和HPLC联用技术，实现了对23BD立体异构体的精准检测，确认主要产物为R,R-23BD（占比85%以上）。

该研究在工艺优化方面取得重要进展：首先，通过降低纤维素浓度（5 g/L vs 20 g/L）和调节pH值（6.0-7.2），发现初始pH值6.5时23BD产率最高（达24%）。其次，引入外源电子传递链（如NADH再生系统）可使代谢流效率提升15%-20%。第三，通过基因敲除（Δhpt）和抗生素筛选（Tm15），建立了稳定的遗传改造体系，确保目标基因的高效表达。

在产业化应用层面，研究团队提出三阶段优化策略：第一阶段（基础工程）通过异源表达核心酶基因，实现23BD基础产量；第二阶段（代谢调控）通过添加醋酸（5-20 g/L）和调节pH值，优化氧化还原平衡；第三阶段（系统整合）将23BD合成与纤维素分解耦合，开发连续发酵工艺。预实验表明，采用50 mL摇瓶培养（转速180 rpm，55℃）时，AG9463菌株的23BD产量可达22.3 mM，产率提升至27%。

该研究还揭示了C. thermocellum独特的代谢特性：其糖酵解途径可同时生成NADH和NADPH，但23BD合成主要依赖NADH再生系统。通过引入Serratia marcescens的FDH（Formate Dehydrogenase）基因，实现了NADH的闭环再生，使23BD产率提升至理论最大值的85%。

未来研究方向包括：（1）挖掘C. thermocellum基因组中潜在未注释的ALDC和BDH同源基因；（2）开发基于人工智能的酶定向进化平台，优化alsD和gdh的热稳定性；（3）构建多酶协同表达系统，通过模块化设计提升代谢流通量；（4）研究醋酸添加的分子机制，包括膜转运蛋白的基因挖掘和跨膜电位调控。这些创新策略有望将23BD的产率提升至工业可接受水平（>50 g/L）。

该成果为纤维素生物精炼提供了新范式，验证了C. thermocellum作为高效生物催化剂的潜力。通过细胞外系统生物学方法，不仅解决了传统代谢工程中"黑箱"问题，还建立了非模式生物的快速诊断体系，为其他工业菌株的改造提供了方法论参考。研究团队已申请相关专利（公开号：CN2024XXXXXXX），并计划与生物能源企业合作开发中试规模的生物反应器。