《Nano Today》：Biohybrid decellularized peritumoral tissue hydrogel for liver failure treatment
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本研究提出一种新型生物杂交疗法，利用脱细胞肿瘤周围组织水凝胶负载干细胞外泌体治疗急性肝衰竭。该方法通过温和脱细胞处理保留生物活性成分并降低免疫原性，结合诱导多能干细胞来源肝细胞（iPS-Heps）与间充质干细胞外泌体，显著提升肝细胞代谢功能及肝功能指标（ALB、CYP450），在D-半乳糖胺诱导的大鼠肝衰竭模型中有效改善生存率、减少肝坏死并抑制炎症反应，为临床治疗提供新策略。
葛东雪|王忠霞|陈大宇|李峰|任浩珍
上海中医药大学附属龙华医院，普通外科第二病房，中国上海市宛平南路725号，200032
摘要
组织工程被认为是治疗急性肝衰竭（ALF）的一种有前景的策略，但目前受到天然支架材料缺乏和有效促进再生的方法不足的限制。在这里，我们提出了一种使用生物混合脱细胞肿瘤周围组织水凝胶的治疗策略，该水凝胶负载了干细胞外泌体（exos），用于治疗肝衰竭。具体来说，在临床过程中获得的组织样本通常作为医疗废物被丢弃，但可以作为治疗应用的天然支架。得益于温和的脱细胞过程，脱细胞肿瘤周围组织保留了大量的生物活性物质，同时保持了低免疫原性。此外，在脱细胞细胞外基质（dECM）水凝胶中培养的诱导多能干细胞衍生的肝细胞（iPS-Heps）表现出强大的代谢活性。更重要的是，加入间充质干细胞（MSCs）外泌体使它们固有的再生细胞因子能够有效地整合到水凝胶中。体外研究表明，这种水凝胶表达了高水平的肝功能，如白蛋白（ALB）和细胞色素P450蛋白（CYP）家族。在D-半乳糖胺诱导的肝衰竭大鼠模型中，负载外泌体的dECM水凝胶显著提高了存活率，减轻了肝坏死，并抑制了局部炎症反应。这种方法不仅保留了组织中的生物活性物质，还增强了肝细胞的代谢活性，从而为改善临床结果提供了潜力。
引言
急性肝衰竭（ALF）是一种严重且常常致命的疾病，其特征是肝功能迅速恶化以及肝细胞大量丢失[1]。目前的治疗选择主要是肝移植，但受到供体器官稀缺和相关风险严重的限制[2]。组织工程作为一种有前景的ALF治疗替代策略应运而生[3]。通过去除细胞成分同时保留天然细胞外基质（ECM）的过程生成的脱细胞支架，为组织再生提供了一个独特的平台[4]、[5]。这些支架不仅为细胞粘附和增殖提供了结构支持，还保留了指导细胞行为和组织结构的生物活性分子[6]、[7]、[8]。重要的是，由于温和的脱细胞过程，脱细胞ECM（dECM）支架表现出较低的免疫原性，使其成为细胞疗法的理想候选材料[9]、[10]、[11]。然而，尽管有这些优势，目前的ALF组织工程方法仍面临局限性。一个主要问题是自体来源的脱细胞支架稀缺，这限制了其广泛应用[12]。此外，仅接种肝细胞的单一支架缺乏有效的再生促进方法和足够的抗炎能力，大大限制了治疗效果[13]。
在这里，我们提出了一种使用生物混合脱细胞肿瘤周围组织水凝胶的新治疗策略，该水凝胶负载了干细胞外泌体（exos），用于治疗肝衰竭。这种方法利用了来自患者废弃组织的脱细胞支架的独特优势，这些支架保留了天然组织结构和生物活性分子，同时表现出低免疫原性[14]。这使它们成为细胞疗法的理想候选材料，特别是在肝组织工程中[15]。此外，间充质干细胞衍生的外泌体（MSC-exos）表现出显著的再生特性，携带的生物活性分子可以介导组织修复、调节炎症并通过旁分泌信号增强细胞存活[16]、[17]、[18]。通过将废弃组织的脱细胞支架与外泌体结合，我们旨在建立一种协同效应，以增强肝脏再生。这种组合提供了结构支持和促进组织修复及减轻炎症的生物活性因子，从而克服了当前单一支架方法的局限性。这种综合策略代表了肝脏再生疗法的重大进展。
在这项研究中，我们开发了一种含有肝细胞和MSC-exos的脱细胞肿瘤周围组织水凝胶，用于ALF治疗。脱细胞支架是通过温和的脱细胞过程制备的，该过程保留了天然ECM结构和生物活性成分，同时消除了细胞抗原。在这种dECM水凝胶中培养的iPS-Heps表现出对肝功能至关重要的强大代谢活性。MSC-exos将其固有的促再生细胞因子有效地整合到了水凝胶基质中。体外评估显示，这种水凝胶增强了肝特异性功能，包括白蛋白（ALB）和细胞色素P450蛋白（CYP）家族的活性。在D-半乳糖胺诱导的肝衰竭大鼠模型中，负载外泌体的dECM水凝胶显著提高了存活率，减少了肝坏死，并减弱了局部炎症反应。这种创新方法既保留了组织中的生物活性物质，又增强了肝细胞的代谢活性，因此显示出在肝病治疗中改善临床结果的潜力。（图1）。
部分摘录
人肝肿瘤周围组织的脱细胞效率
肝肿瘤组织经过Triton-X 100处理以实现脱细胞[19]，并通过组织学染色和生化定量评估了细胞成分的去除情况（图2a和图S1）。Hematoxylin和eosin（H&E）染色以及Masson染色显示了ECM的结构完整性，并验证了细胞成分的去除。H&E染色显示没有完整的细胞核，表明脱细胞过程成功
结论
总之，这项研究阐明了使用负载干细胞外泌体的脱细胞肿瘤周围组织水凝胶作为ALF新治疗模式的潜力。脱细胞过程保留了关键的生物活性成分，同时最小化了免疫原性，使其成为肝脏再生的理想生物材料。将iPS-Heps整合到水凝胶中促进了强大的代谢活性和解毒相关基因（如ALB）的表达
材料
术后肿瘤周围组织来自南京鼓楼医院肝胆外科。青霉素-链霉素溶液、RPMI-1640和DMEM培养基以及Trypsin-EDTA（0.25%）从Gibco购买。Beckman Coulter Ultra-Clear?离心管从Beckman Coulter获得，Triton-X 100、氯化钠、PBS缓冲液和其他常规化学试剂从Sigma-Aldrich购买。H&E染色试剂盒、Masson Trichrome
CRediT作者贡献声明
任浩珍：资金获取、概念构思。李峰：撰写 – 审稿与编辑。王忠霞：撰写 – 初稿。葛东雪：撰写 – 初稿、方法学。陈大宇：撰写 – 初稿。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
这项工作得到了江苏省概念验证中心-南京鼓楼医院专项基金项目（2024-GNYZ-ZD-03）、南京鼓楼医院临床研究项目（2022-LCYJ-35）以及南京市卫生健康委员会支持的医学科学技术发展基金重点项目（编号YKK24111）的支持。
