《Scientific Reports》：HMBOX1 plays a critical role in plumbagin-induced growth inhibition of hepatocellular carcinoma cells
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本研究针对肝细胞癌（HCC）治疗预后差、缺乏有效靶点的问题，通过全基因组CRISPR/Cas9文库筛选，首次发现转录抑制因子HMBOX1是天然化合物白花丹素（PLB）发挥抗HCC作用的关键靶点。研究证实，PLB通过上调HMBOX1表达，进而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而在体内外抑制HCC细胞增殖并诱导凋亡。该发现揭示了HMBOX1在HCC中的抑癌作用，为PLB的临床应用提供了新的理论依据。
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，严重威胁人类健康。尽管近年来治疗手段不断进步，但HCC患者的5年生存率仍不理想，寻找新的治疗靶点和有效的治疗药物迫在眉睫。白花丹素（Plumbagin, PLB）是一种从白花丹中提取的天然萘醌类化合物，具有广泛的抗肿瘤活性。前期研究表明，PLB能够通过诱导活性氧（ROS）介导的DNA损伤、调控ATM-p53信号通路以及抑制PI3K/Akt信号通路等多种机制抑制HCC的生长。然而，PLB发挥抗HCC作用的上游调控因子尚不明确，这限制了其临床应用的深入开发。
为了揭示PLB抗HCC作用的上游分子机制，广西中医药大学邓书烨教授团队在《Scientific Reports》上发表了一项研究，他们利用全基因组CRISPR/Cas9文库筛选技术，首次鉴定出转录抑制因子HMBOX1是PLB发挥抗HCC作用的关键调控因子。该研究不仅阐明了HMBOX1在HCC中的抑癌作用，还揭示了PLB通过上调HMBOX1表达，进而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，最终抑制HCC生长的分子机制。
关键实验方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：利用全基因组CRISPR/Cas9文库（GeCKO v2）在Huh-7细胞中进行筛选，以鉴定PLB抗HCC作用的关键基因；通过慢病毒介导的基因敲低和过表达技术，在Huh-7细胞中构建HMBOX1敲低和过表达细胞模型；采用CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测细胞活力和凋亡；利用蛋白质印迹法（Western Blot）检测相关蛋白表达；建立Huh-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型，进行体内药效学评价；通过免疫组织化学染色（IHC）分析肿瘤组织中相关蛋白的表达水平。
研究结果
PLB在体内外抑制HCC生长
研究人员首先验证了PLB对HCC细胞的抑制作用。体外实验结果显示，PLB能够以剂量和时间依赖的方式显著抑制Huh-7和LM3细胞的活力，并诱导细胞凋亡。同时，PLB处理显著降低了HCC细胞的克隆形成能力。在体内实验中，PLB治疗显著抑制了Huh-7细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，表现为肿瘤体积和重量的显著减小。这些结果证实了PLB在体内外均能有效抑制HCC的生长。
HMBOX1被鉴定为PLB抗HCC作用的关键调控因子
为了寻找PLB抗HCC作用的上游调控因子，研究人员利用CRISPR/Cas9全基因组文库在Huh-7细胞中进行筛选。通过比较PLB处理组和DMSO对照组中sgRNA的富集情况，他们发现靶向HMBOX1的sgRNA在PLB处理组中显著富集，提示敲低HMBOX1可能使HCC细胞对PLB产生抵抗。进一步分析TCGA和CPTAC数据库发现，HMBOX1在HCC组织中的表达水平显著低于正常组织，提示HMBOX1可能是一个潜在的抑癌基因。
HMBOX1调控HCC细胞生长并影响PI3K/Akt/mTOR通路
为了验证HMBOX1的功能，研究人员在Huh-7细胞中敲低了HMBOX1的表达。结果显示，敲低HMBOX1显著增强了细胞的活力和克隆形成能力。相反，过表达HMBOX1则抑制了细胞的生长。机制研究表明，敲低HMBOX1激活了PI3K/Akt/mTOR信号通路，而过表达HMBOX1则抑制了该通路。这些结果表明，HMBOX1通过调控PI3K/Akt/mTOR通路在HCC中发挥抑癌作用。
HMBOX1介导PLB对HCC的抑制作用
研究人员进一步探讨了HMBOX1在PLB抗HCC作用中的角色。他们发现，PLB能够以剂量依赖的方式上调HMBOX1的mRNA和蛋白表达水平。在敲低HMBOX1的Huh-7细胞中，PLB对细胞生长的抑制作用被显著削弱。同时，PLB对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制作用在敲低HMBOX1的细胞中也明显减弱。这些结果证实，HMBOX1是PLB抑制HCC生长和PI3K/Akt/mTOR通路的关键介导因子。
敲低HMBOX1减弱PLB在体内的抗肿瘤作用
为了在体内验证HMBOX1的作用，研究人员构建了HMBOX1敲低的Huh-7细胞裸鼠移植瘤模型。结果显示，与对照组相比，敲低HMBOX1显著促进了肿瘤的生长。PLB治疗在对照组中表现出显著的抗肿瘤效果，但在HMBOX1敲低组中，PLB的抗肿瘤作用被显著削弱。免疫组织化学染色分析显示，PLB治疗降低了肿瘤组织中Ki-67、p-mTOR、p-PI3K和p-AKT的表达，并增加了Bax的表达；而敲低HMBOX1则逆转了这些变化。这些体内实验数据进一步证实，HMBOX1是PLB通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路发挥抗HCC作用的关键分子。
结论与讨论
本研究通过全基因组CRISPR/Cas9文库筛选，首次将转录抑制因子HMBOX1鉴定为天然化合物白花丹素（PLB）抗肝细胞癌（HCC）作用的关键调控因子。研究证实，HMBOX1在HCC组织中表达下调，其本身具有抑制HCC细胞生长的作用。PLB通过上调HMBOX1的表达，进而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性，最终发挥抑制HCC细胞增殖和诱导凋亡的作用。体内外实验均证实，敲低HMBOX1会显著削弱PLB的抗肿瘤效果。
该研究的重要意义在于，它不仅揭示了HMBOX1在HCC中的抑癌作用，还阐明了PLB抗HCC作用的新机制，为PLB的临床应用提供了新的理论依据。HMBOX1作为PLB作用的关键靶点，有望成为HCC治疗的一个新靶点。然而，HMBOX1调控PI3K/Akt/mTOR通路的具体分子机制仍有待进一步研究，未来需要更多的实验来验证这一机制在其他HCC细胞系中的普适性，以推动其向临床转化。
