对氯乐奎酸（Chlormequat chloride）具有响应性的VviDOF3.4-VviLBD36模块调控葡萄藤的不定根形成

葡萄不定根形成中VviDOF3.4通过激活VviLBD36促进根发育的分子机制研究。摘要：通过转录组测序和功能验证发现， CCC处理显著促进葡萄‘Thompson Seedless’不定根形成，并鉴定出VviDOF3.4-VviLBD36调控模块。VviDOF3.4结合VviLBD36启动子激活其表达，在拟南芥中过表达VviLBD36和VviDOF3.4均显著增加不定根和侧根数量。

　　
本研究以葡萄（*Vitis vinifera*）为对象，系统探究了植物生长抑制剂氯苯丁胺（CCC）对不定根（Adventitious Root, AR）形成的调控机制。通过转录组测序结合基因功能验证，首次揭示了DOF家族转录因子VviDOF3.4与LBD家族转录因子VviLBD36协同作用的关键调控路径，为植物繁殖生物学和农业应用提供了新视角。

### 研究背景与意义
葡萄作为全球第二大水果作物，其无性繁殖依赖不定根的形成能力。然而，不同栽培品种间不定根发生率差异显著，严重制约了规模化生产。现有研究多聚焦于 auxin（生长素）和 cytokinin（细胞分裂素）的激素平衡调控，但对CCC这类新型调控因子的分子机制关注不足。CCC作为赤霉素合成抑制剂，虽在农业中广泛应用，但其对AR形成的具体作用靶点尚不明确。

### 实验设计与方法
研究采用“转录组测序-功能验证”的递进式策略：
1. **材料处理**：选取‘ Thompson Seedless’品种的6-8 cm幼苗，通过离体培养结合不同处理组（1/2 MS对照 vs CCC处理）进行对照实验
2. **转录组分析**：利用RNA测序技术获取CCC处理组在不同时间点（14天、21天）的转录本全景数据，通过差异表达分析（|log2FC|≥1.0，padj<0.05）筛选出2237个差异基因
3. **共表达网络分析**：采用加权基因共表达网络分析（WGCNA），发现与CCC响应最相关的“紫色模块”包含118个差异表达基因，其中VviLBD36以5.13倍显著上调成为核心候选基因
4. **基因功能验证**：
- **亚细胞定位**：通过YFP融合蛋白瞬时表达技术，证实VviLBD36定位于细胞核
- **基因互作验证**：酵母双杂交（Y1H）和双荧光素酶报告基因系统证实VviDOF3.4可直接结合VviLBD36启动子并激活其转录
- **模式生物验证**：在拟南芥中过表达VviLBD36和VviDOF3.4，均显著促进不定根和侧根发育

### 关键发现
1. **CCC促进AR形成的分子机制**
- 激活VviLBD36基因表达：通过qPCR验证，CCC处理14天内VviLBD36表达量激增5.13倍（p<0.001），且其表达模式与AR形成进程高度同步
- DOF转录因子VviDOF3.4的调控作用：该因子不仅自身表达在CCC处理下显著上调（p<0.001），更能通过直接结合VviLBD36启动子区域（距离启动子2000bp内预测到9个结合位点）激活其转录

2. **功能验证的跨物种保守性**
- 拟南芥实验显示：VviLBD36过表达植株不定根数量增加2.3倍（p<0.001），侧根数量提升1.8倍（p<0.01）
- VviDOF3.4过表达拟南芥同样呈现侧根发育增强趋势（LR数量增加42%，p<0.05）

3. **调控网络的新解析**
建立首个葡萄VviDOF3.4-VviLBD36调控模块：
```text
CCC处理 → VviDOF3.4表达↑ → 启动子结合↑ → VviLBD36转录↑ → AR相关基因表达↑ → AR形成增强
```
该模块与水稻根系发育调控网络存在同源性，但具体激活下游基因的靶点尚未完全明确。

### 理论创新与突破
1. **首次揭示CCC的AR调控机制**：突破传统认知中CCC抑制生长素信号传导的单一作用模式，发现其通过DOF-LBD正调控模块促进AR形成
2. **LBD家族功能的扩展**：不同于已知的LBD Class I调控侧根的普遍认知，本研究的VviLBD36在AR形成中发挥更关键作用，其表达水平与AR数量呈显著正相关（R2=0.87）
3. **基因互作的跨物种验证**：在模式植物拟南芥中成功复现葡萄VviLBD36的AR促进效应，且VviDOF3.4的侧根调控功能与拟南芥WUS（碗状）等已知因子存在协同效应

### 农业应用潜力
1. **无性繁殖效率提升**：通过外源施加CCC（200 mg/L），葡萄扦插苗的AR形成率可从常规处理的32%提升至68%（实验组数据）
2. **基因编辑技术靶向**：基于本研究的分子机制，CRISPR/Cas9技术敲除VviDOF3.4可导致AR形成率下降42%（p<0.01），验证了该因子的必要性
3. **绿色调控剂开发**：相比传统 auxin 类药剂（如NAA），CCC具有更少的土壤残留（30天降解率>85%）和更强的环境适应性

### 局限与展望
1. **研究局限**：目前仅在离体培养条件下验证了基因功能，田间试验数据尚不足
2. **机制待解**：DOF转录因子与LBD转录因子的级联激活机制仍需通过时空表达图谱和互作蛋白组学深入探究
3. **应用前景**：计划开展不同CCC浓度梯度（50-300 mg/L）的田间试验，结合表观遗传学手段解析其作用机制

本研究为植物生长调节剂的作用机制研究提供了新范式，通过解析DOF-LBD转录调控网络，不仅深化了对赤霉素抗性机制的理解，更为开发新型绿色园艺调控剂开辟了技术路径。后续研究将聚焦于该调控网络在干旱/盐胁迫下的动态变化，以及与韧皮部运输相关的信号通路交互作用。