《Nature Communications》：Germline epigenome editing identifies H3K9me3 as a mediator of intergenerational DNA methylation recovery in mice
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本研究针对表观遗传跨代遗传机制的关键争议，开发了精子特异性表观基因组编辑系统，通过靶向清除H19基因差异甲基化区域（H19-DMR）的DNA甲基化，模拟Silver-Russell综合征模型。研究发现，尽管精子中H19-DMR甲基化完全缺失，但在胚胎植入前发育过程中出现部分恢复，且这一过程依赖于受精后沉积的组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）。通过靶向编辑技术证实H3K9me3是介导DNA甲基化重建的关键介质，揭示了代际表观遗传记忆的重编程机制，为印记疾病研究和生殖系表观遗传干预提供了新范式。
在遗传学教科书中，生物性状的传递通常被归因于DNA序列的遗传。然而，越来越多的证据表明，亲代的环境暴露（如营养异常、毒素或应激）可能通过非孟德尔遗传的方式影响后代的健康。这种现象被称为表观遗传跨代遗传，但其分子机制一直存在争议，尤其是难以排除潜在遗传突变的影响。基因组印记作为经典的表观遗传调控模型，为研究这一问题提供了独特窗口。其中，H19/Igf2印记控制区域（H19-DMR）的甲基化异常会导致Silver-Russell综合征，表现为胎儿宫内生长受限。然而，精子中诱导的表观突变是否及如何传递给后代，仍是未解之谜。
为了直接验证表观遗传跨代遗传，日本群马大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表最新研究，开发了一种精子特异性表观基因组编辑系统，通过靶向清除H19-DMR的DNA甲基化，首次揭示了H3K9me3介导的代际DNA甲基化恢复机制。
研究团队首先构建了由Stra8启动子驱动的表观基因组编辑载体（pStrPlatTET-gRNA2-H19DMRx9），将dCas9-SunTag与TET1催化结构域融合，通过9条gRNA靶向H19-DMR，实现精子发生过程中特异的DNA去甲基化。通过显微注射建立转基因小鼠品系（StrH19EpiTG），免疫组化和RT-qPCR证实编辑因子仅在睾丸精原细胞和精母细胞中表达。甲基化分析显示，转基因小鼠精子中H19-DMR甲基化完全缺失，而卵母细胞中无变化，且6个潜在脱靶区域未受影响。
靶向H19-DMR去甲基化部分遗传至后代并引发表型变化
转基因雄鼠与野生型雌鼠交配产生的F1代出现出生体重降低、产后生长迟缓、摄食减少及身体不对称等Silver-Russell综合征样表型。甲基化分析显示，F1代新生儿H19-DMR（CTCF结合位点m1-m4）甲基化水平显著低于野生型父本后代，且Igf2表达下调、H19表达上调。值得注意的是，非转基因F1代同样出现甲基化缺失和基因表达改变，排除了转基因整合的直接影响。而转基因母鼠后代未出现异常，符合H19-DMR在卵母中本不甲基化的特征。此外，F1代非转基因小鼠精子中H19-DMR甲基化恢复正常，且F2代未继承低甲基化，表明该表观突变仅存在代际遗传，无跨代遗传。
H19-DMR甲基化在胚胎发生过程中从5′端部分恢复
尽管精子中甲基化完全缺失，新生儿中H19-DMR甲基化呈现部分恢复，且恢复程度与出生体重正相关。时序分析发现，DMR的5′端（m1、m2位点）在植入前（桑椹胚阶段）即恢复甲基化，而3′端（m3、m4位点）在E7.5后才逐步恢复。等位特异性分析证实，父源等位基因在受精后发生甲基化重建，提示存在未知因子介导早期胚胎的甲基化恢复。
H3K9me3是DNA甲基化恢复的必要介质
通过超灵敏染色质免疫沉淀测序（CATCH-seq）发现，H3K9me3在受精后5小时的早期合子中即沉积于H19-DMR父源等位基因的5′端，并在桑椹胚阶段进一步积累。为验证其功能，研究团队向转基因父本来源的合子中注射dCas9-SunTag-Kdm4d系统，靶向清除H19-DMR上游的H3K9me3。结果显示，组蛋白编辑后桑椹胚中H19-DMR区域H3K9me3几乎完全缺失，而其他印记基因（如Igf2r、Rasgrf1）未受影响。全基因组分析仅发现18个区域（包括H19-DMR）的H3K9me3显著丢失，证明编辑具有高度特异性。
E11.5胚胎分析表明，靶向清除H3K9me3完全抑制了DNA甲基化恢复，而酶活缺失的KDM4D突变体或H3K27me3去甲基化酶KDM6B均无此效应。靶向Rosa26位点的对照组仍出现部分甲基化恢复，排除了dCas9复合物的空间位阻影响。E15.5和E18.5胚胎表型分析进一步显示，H3K9me3清除导致更严重的宫内生长受限。全局性Kdm4d mRNA注射实验也证实H3K9me3缺失对DNA甲基化恢复的抑制作用。
研究结论与意义
本研究通过创新性生殖系表观基因组编辑工具，揭示了H3K9me3在介导代际DNA甲基化恢复中的核心作用：在野生型胚胎中，父源H19-DMR在受精后迅速被H3K9me3标记，并通过与DNA甲基化协同维持印记稳定性；在编辑模型胚胎中，精子来源的低甲基化状态虽被部分继承，但H3K9me3指导的de novo甲基化实现了区域性重建；若清除H3K9me3，则DNA甲基化恢复被完全阻断。
该研究不仅提供了直接证据证明表观突变可代际遗传但无法跨代维持，还首次确立了H3K9me3作为DNA甲基化重建的“向导”分子。这一机制可能广泛存在于印记基因及其他表观敏感区域，为理解不孕症患者精子表观突变、衰老相关甲基化异常等提供了新视角。研究所开发的精子特异性编辑平台，为精准研究疾病相关表观突变的遗传与修复机制奠定了技术基础。
