《Biosensors and Bioelectronics》：Self-priming amplification-integrated orthogonal CRISPR-Cas system for multiplexed profiling of piRNAs in clinical samples
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CRISPR/Cas系统通过整合自 priming 扩增和正交切割（Cas12a/Cas13a）实现piRNA高灵敏度多组学检测，无需反转录且能区分癌变组织，并扩展至结直肠癌相关piRNA检测。
Jie Zhang|Wen-jing Liu|Fei Ma|Chun-yang Zhang
东南大学化学与化学工程学院，数字医学工程国家重点实验室，南京，211189，中国
摘要
基于CRISPR/Cas的生物传感器具有巨大的诊断潜力，但在临床应用中常常受到灵敏度不足和缺乏多重分析能力的限制。为了解决这些问题，我们开发了一种自启动扩增集成正交CRISPR-Cas（SPA-OCRISPR）系统，用于多重检测piRNAs。该检测方法采用了一种创新的四向连接探针，将目标识别与无需引物的自启动扩增无缝结合，显著简化了工作流程并提高了连接效率。高保真的SplitR连接酶介导的转导保证了出色的特异性，有效消除了对逆转录的需求。利用Cas12a和Cas13a的正交切割活性，可以生成具有最小交叉干扰的独特荧光信号，从而实现多重分析。这种策略可以达到原子摩尔级别的灵敏度和良好的特异性。此外，它还可以成功量化临床组织中的乳腺癌相关piRNAs（piR-651和piR-36026），并准确区分癌组织和健康组织。重要的是，这种策略具有很好的通用性，只需简单修改连接探针的识别序列，即可扩展用于检测结直肠癌相关piRNAs（piR-823和piR-54265），凸显了其在多重分析和临床癌症诊断中的广泛潜力。
引言
CRISPR/Cas代表规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白，可作为适应性免疫机制，保护细菌和古菌免受病毒感染（Makarova等人，2011；Ruffolo等人，2025）。近年来，该系统已被广泛应用于基因编辑、基因组筛查、表观遗传调控和生物检测等领域（Barber等人，2025；Lu等人，2024；Ruffolo等人，2025；Weng等人，2023）。由于其高特异性、易于重新编程和强大的切割效率，CRISPR/Cas已成为一种精确的识别工具和信号转导组件，能够检测多种生物标志物（如DNA、RNA、酶、病毒和细胞），在分子诊断中具有巨大潜力（Guo等人，2024；Li等人，2023；Qin等人，2019；Sridhara等人，2021；Zhao等人，2024a）。
值得注意的是，基于CRISPR/Cas的检测方法通常灵敏度不够理想，通常需要在检测前进行预扩增以提高目标浓度（Hu等人，2025a；Zeng等人，2024）。聚合酶链反应（PCR）是CRISPR/Cas检测中最常用的预扩增方法（Lee等人，2017；Zheng等人，2024），但需要热循环仪进行精确的温度控制。此外，还开发了几种等温扩增方法用于CRISPR/Cas信号扩增，包括重组酶聚合酶扩增（RPA）（Aman等人，2020；Wang等人，2024）、链置换扩增（SDA）（Hu等人，2025b；Xu等人，2025；Zhou等人，2018）、滚环扩增（RCA）（Shen等人，2024；Wu等人，2023；Zhao等人，2024b）和环介导的等温扩增（LAMP）（Dai等人，2025；Sen等人，2024）。其中，RPA和SDA相对复杂，因为它们依赖于多种组件（如聚合酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和切割酶）来实现扩增。相比之下，RCA原理更简单，仅需要一种DNA聚合酶进行扩增。然而，额外的探针环化步骤使得检测过程成本高昂且耗时。同样，LAMP也只使用一种DNA聚合酶，可以实现高扩增效率且检测时间较短。然而，它通常需要4-6个引物，这些引物的设计较为困难。
基于CRISPR/Cas的检测方法的多重检测能力常常受到Cas效应子非特异性 collateral切割活性的阻碍。实现多重CRISPR/Cas检测的最直接方法是利用微流控平台（Zhang等人，2024；Zhang等人，2025）、微阵列（Thakku等人，2022）、水凝胶（Roh等人，2023）和纸条测试条（Wei等人，2025）对多个CRISPR/Cas反应进行空间分离，但这些分离步骤相当复杂且繁琐。另一种方法是利用正交Cas效应子，以均匀的方式同时识别多个目标。Cas12和Cas13是最常用的正交Cas效应子。Cas12在DNA目标激活下切割附近的单链DNA（Yin等人，2025），而Cas13在RNA目标激活下切割相邻的单链RNA（Feng等人，2024；Yang等人，2024）。结合使用Cas12和Cas13可以实现相应单链DNA和单链RNA报告分子的正交切割，以区分不同的目标信号。在这里，我们通过将无需引物的自启动扩增与正交CRISPR Cas12a/Cas13a结合，开发了一种新的多重CRISPR-Cas检测平台。该检测方法简单、灵敏且具有选择性，无需复杂的检测设计、精确的温度控制和繁琐的分离步骤。
部分摘要
概述
化学品和材料、寡核苷酸序列（表S1）、荧光测量、细胞培养、RNA提取和qRT-PCR检测方法详见补充信息。
四向连接探针的组装
将分裂探针以最终浓度10 μM混合在1 × 退火缓冲液（10 mM Tris-HCl，5 mM MgCl2，pH 8.0）中，最终体积为10 μL。然后在37 °C下孵育1.5小时，形成四向连接探针。
自启动扩增集成正交CRISPR-Cas检测
反应体积为5 μL，含有1× SplintR连接酶反应缓冲液，
SPA-OCRISPR用于piRNA检测的原理
piRNAs是一类新发现的小型非编码RNA（24-31 nt），它们通过沉默转座子发挥维持基因组完整性的关键作用（Dias Mirandela等人，2024）。异常的piRNA表达与多种癌症密切相关，表明它们作为癌症诊断的生物标志物具有巨大潜力（Assump??o等人，2015；Ben等人，2024；Taghizadeh等人，2024）。我们开发了一种无需引物的自启动扩增集成正交CRISPR-Cas系统，用于
结论
总之，我们开发了一种自启动扩增集成正交CRISPR-Cas（SPA-OCRISPR）系统，用于临床样本中piRNAs的多重检测。该策略具有简化的工作流程，集成了4WJP探针，将目标识别与自启动扩增结合，提高了连接效率并减少了错误。通过SplitR连接酶介导的探针连接实现了高特异性，无需逆转录过程。
CRediT作者贡献声明
Chun-yang Zhang：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。Jie Zhang：撰写 – 原始草稿、方法学、实验设计。Wen-jing Liu：撰写 – 原始草稿、方法学、概念构思。Fei Ma：撰写 – 审稿与编辑、概念构思
未引用参考文献
Hu等人，2025；Zhao等人，2024。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了江苏省前沿技术研发计划（BF2024063）的支持。
