《Cytotherapy》：DEVELOPMENT OF A PRACTICAL GMP-COMPLIANT MANUFACTURING PROCESS FOR T CELL-DERIVED INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS.
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制造符合GMP标准的自体诱导多能干细胞（iPSCs），通过Sendai病毒载体对健康男性供体外周血单核细胞（PBMCs）中富集的T细胞进行重编程，获得20个iPSC克隆，其中13个通过基因完整性、纯度和无菌性检测，揭示PRSS1基因缺失和Y染色体异常现象
Ruud Hulspas|Carolina Sasso|Amy Cunningham|José A Cancelas|Laurence M Daheron|Jerome Ritz
康奈尔与奥赖利家族细胞操作核心设施，达纳-法伯癌症研究所，Smith研究大楼，SM-1101，450 Brookline Avenue，波士顿，MA 02215
摘要
我们提出了一种符合GMP标准的自体诱导多能干细胞（iPSC）生产工作流程的实用方法。在该方法中，使用市售的GMP级Sendai病毒载体对来自健康男性捐赠者的活化、富集T细胞的外周血单核细胞（PBMCs）进行了重编程。最终获得了20个iPSC克隆，所有克隆均表现出高水平的多能性标志物（Oct-4和TRA-1-60的表达率超过85%，而SSEA-1的表达率低于1%）。通过TCR β链基因序列分析，确认了20个iPS系中有18个来源于T细胞。其中14个iPS系含有独特的、克隆间不同的TCR β链基因序列，表明它们来源于单个T细胞。值得注意的是，有三个系似乎来源于那些由于初始β链重排失败而未能发生等位基因排除的T细胞，导致这些克隆仅含有50%的功能性TCR β链基因序列。通过G带核型分析发现这三个系中存在额外的Y染色体，这些克隆均来源于同一个亲本克隆。对大约500个与癌症相关的基因（OncoPanel检测）进行靶向测序后发现，所有T细胞来源的iPSC系中均存在丝氨酸蛋白酶1基因（PRSS1）的重复缺失，且这种缺失在捐赠者的成熟、未重编程的T细胞中也存在。PRSS1基因位于TCR β位点，在TCR基因重排过程中经常发生缺失。在满足所有质量控制及放行标准后（包括无菌性、身份鉴定、载体清除和基因组完整性评估），我们获得了13个独特的T细胞来源的iPSC系，这些系被认为适用于后续的临床或转化应用。除了技术验证外，我们还描述了一种优化生产工作流程的方法，以提高临床环境中的操作效率。这些方法包括预先定义的流程暂停步骤，以管理人员和易过期材料，从而增强了在实际GMP合规工作环境中生产iPSC的可行性和可重复性。
章节摘录
引言
最初开发的符合cGMP标准的诱导多能干细胞（iPSC）生产流程侧重于非整合型重编程方法、使用临床级起始材料以及采用无动物成分的试剂[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]]。这些共同努力产生了多个临床级的iPSC系，为越来越多的利用多种iPSC衍生细胞类型的临床研究提供了支持。
T细胞富集与活化
捐赠者血液由Research Blood Components, LLC（马萨诸塞州沃特敦）提供。使用标准Ficoll-Paque?密度梯度离心法从48毫升全血中分离出外周血单核细胞（PBMCs）。细胞培养液为X-Vivo15/5% huAB血清（LONZA，美国马里兰州沃克斯维尔）和GeminiBio（美国加利福尼亚州西萨克拉门托），其中含有MACS?抗CD3和抗CD28抗体（分别为0.4 ng/mL和0.2 ng/mL，Miltenyi Biotec，德国贝吉施格拉德巴赫）以及白细胞介素-2（100 IU/ml）。
结果
为了提高我们基于T细胞的iPSC生产方法的实用性和可靠性，我们将整个过程分为四个模块：（1）PBMCs的处理；（2）T细胞的重编程和克隆；（3）iPSC种子系的建立；（4）主细胞库的生成（图1）。
在自体应用中，由于后续分化过程所需的iPSC数量较少，仅种子系阶段通常就能提供足够的起始材料。
讨论
我们提供了一个实际的例子，说明如何使用CTS? CytoTune? iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit [20]对来自健康捐赠者的活化、富集T细胞的外周血单核细胞进行重编程，从而产生了20个iPSC克隆。经过载体清除、流式细胞术检测多能性以及克隆性和基因组完整性的评估后，13个独特的iPSC系符合所有预定义的放行标准（补充表2）。无菌性检测并未使其不符合要求。
