《International Journal of Molecular Sciences》：Effect of Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Phytosulfokine-Alpha on Successful Plant Regeneration from Embryogenic Callus-Derived Protoplasts of Garlic (Allium sativum L.)
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本研究针对大蒜（Allium sativum L.）无性繁殖导致的遗传改良瓶颈，建立了一套优化的胚性愈伤组织诱导及原生质体再生体系。研究发现，短期暴露于组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA（0.05/0.1 μM）并持续添加植物磺化因子PSK-α（100 nM），可显著促进原生质体微愈伤形成（成功率70%）及植株再生（97%再生植株保持供体倍性）。该体系为大蒜基因编辑（如CRISPR-Cas）提供了可靠技术平台。
引言
大蒜（Allium sativum L.）作为全球重要的鳞茎作物，因其无性繁殖特性导致遗传改良困难且易传播病害。原生质体技术为遗传工程提供了理想单细胞系统，但单子叶植物（尤其大蒜）的原生质体再生仍存在挑战。本研究旨在通过优化胚性愈伤组织诱导、原生质体分离培养条件，并探索组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA与植物肽激素PSK-α对再生效率的协同作用，建立高效的大蒜原生质体再生体系。
胚性愈伤组织的诱导与组织学分析
研究以四个大蒜种质（Arkus、Messidrome、Ornak、465K）的鳞茎基部为外植体，在含5 μM 2,4-D的K1培养基或添加9 μM BAP的K2培养基上诱导愈伤组织。培养8周后，愈伤形成率在15.3%（Messidrome）至85.4%（465K）之间，其中K2培养基更易诱导出疏松型愈伤组织。组织学切片显示，疏松愈伤组织中的球形结构由胚胎发生区（小型致密细胞、大核、活跃有丝分裂）和非胚胎发生区（大液泡化细胞）组成。将胚胎发生愈伤组织转移至无激素1/2 BDS培养基后，可观察到体细胞胚胎发育为成熟植株，且再生植株均保持供体倍性。
原生质体分离与培养优化
从10-20日龄胚性愈伤组织中分离原生质体，发现含2%纤维素酶R-10与0.2%果胶酶Y23的HAS+酶解液可获得最高产量（最高达2.1×106个/g鲜重），活力达90%。采用海藻糖包埋法培养原生质体，比较CPP与K8M培养基效果。结果显示，K8M培养基（含KM微量元素与葡萄糖）能显著促进细胞壁重建（72小时完全重建率达21%）、细胞分裂及微愈伤形成。添加PSK-α（100 nM）可维持细胞活力，而短期（24小时）暴露于SAHA（0.05/0.1 μM）能显著提高有丝分裂活性与微愈伤形成频率，其中0.1 μM SAHA效果更优。
SAHA与PSK-α对再生过程的表观遗传调控
组织学观察发现，SAHA处理组的原生质体培养物中细胞质重组、器官重建及分裂现象显著增加。90天培养后，仅SAHA处理组（尤以K8M+PSK+0.1 SAHA组合）的微愈伤具备再生能力，表明SAHA通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）激活胚胎发生相关基因。将微愈伤转移至K1培养基扩增后，再接种至1/2 BDS培养基可诱导体细胞胚胎发生，最终通过U1培养基实现根系发育。再生植株驯化成功率达70%，流式细胞术检测显示97%植株为二倍体，少数四倍体及混倍体植株均源于TSA（曲古抑菌素A）处理组。
讨论与结论
本研究首次证实SAHA与PSK-α协同作用可突破大蒜原生质体再生障碍。SAHA通过表观遗传修饰（如组蛋白H3/H4乙酰化）促进细胞重编程，而PSK-α维持细胞增殖活力。优化后的技术体系（胚性愈伤诱导→HAS+酶解→K8M+PSK+SAHA培养→体细胞胚胎发生）为大蒜基因编辑、体细胞杂交等生物技术应用提供了高效平台，为克服单子叶植物再生难题提供了新思路。
